高效液相色谱法测定复方银杏叶片中银杏总黄酮的含量

amy54321 · 发表于 2014-8-17 22:00:11

【摘要】  目的建立复方银杏叶片中银杏总黄酮含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，用SymmetryC18色谱柱( 250 mm×4.6 mm,5 μm )，以甲醇0.4%磷酸溶液（52∶48）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长360 nm ，柱温35℃。结果该法线性关系良好，平均加样回收率为98.35 % ,　RSD为1.17 % ( n = 5 )。结论该法操作简便，分离效果好，结果准确，专属性强，可作为复方银杏叶片的质量控制方法。

【关键词】  复方银杏叶片；黄酮；槲皮素；山柰素；异鼠李素；高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish the determination method of flavonoids  in compound Ginkgo biloba Leaves Tablets .MethodsThe analysis was performed on a SymmetryC18 column（4.6 mm ×250  mm,5 μm） with methanol 0.4% phosphoric acid( 52:48 ) as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml ·min-1, and at a column temperature of 35℃. The detection wavelength was 360nm.ResultsThe linearity of this method was good.The average recovery of added samples was 98.35 % with RSD 1.17 %. (n =5 ) .ConclusionThe method is convient with a good separating degree for the determination of flavonoids and can be used to evaluate the quality of compound Ginkgo biloba Leaves Tablets.

　　Key words：Compound Ginkgo biloba Leaves Tablets；  Flavonoid；  Quercetin ； Kaempferol；  Isorhamnetin； HPLC

　　复方银杏叶片是由银杏叶提取物和广西野葛根提取物等制成的复方制剂，具有活血化淤，降低血脂，清除自由基和抗衰老等功效和作用［1］。银杏叶中所含的槲皮素、山柰素、异鼠李素等黄酮化合物为其主要有效成分之一。银杏叶中黄酮化合物的测定方法很多，如导数光谱法［2］，近红外光谱法［3］，分光光度法［4］，示波极谱法［5］，荧光光度法［6］，库仑滴定法［7］，毛细管电泳法［8］和高效液相色谱法［9］等。而有关银杏叶和野葛根两者配方制剂中银杏总黄酮含量测定方法尚未见报道。本文采用高效液相色谱法测定复方银杏叶片中槲皮素、山柰素、异鼠李素等黄酮化合物的含量，方法快速简便，分离效果良好，专属性强。可用于复方银杏叶片的质量控制。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器  美国PerKinElmer公司 Series 200高效液相色谱仪（包括Series 200紫外检测器、Series 200二元泵、600 Series 接口及色谱工作站）。

　　1.2  试药  槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为10081200406，110861200405，110860200407）。复方银杏叶片为本课题组在广西科技厅三项基金资助下研制的新产品。甲醇为色谱纯，水为高纯水，磷酸为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件　SymmetryC18 色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm，美国Waters公司），流动相为甲醇∶0.4%磷酸水溶液（52∶48），流速1 ml·min-1，检测波长360 nm，柱温35℃，进样量20 μl。

　　2.2  溶液制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量（15.6，17.0，10.0 mg）置100 ml量瓶中，加甲醇微热使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

　　2.2.2  供试品溶液的制备　取本品10片，除去包衣，研细，精密称取适量（约含银杏总黄酮醇苷19.2 mg），置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml，置100 ml锥形瓶中，加甲醇10 ml、25%盐酸溶液5 ml，摇匀，置水浴中加热回流30 min，迅速冷却至室温，转移至50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

　　2.2.3  阴性对照溶液的制备取处方中除银杏叶提取物以外的其余药材和辅料，按规定工艺制备成片剂后，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

　　2.3  标准曲线的制作  精密量取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，各进样20 μl，按上述色谱条件测定，以对照品浓度C（μg·ml-1 ）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下：

　　槲皮素：A= 80 074C - 52 255， r = 0.999 4，线性范围为15.6～78.0 μg·ml-1

　　山柰素：A = 63 168C + 35 558，r= 0.998 2，  线性范围为17.0 ～85.0  μg· ml-1

　　异鼠李素：A= 60 465C + 20 840，r= 0.999 6，  线性范围为10.0 ～50.0 μg· ml-1

　　2.4 精密度实验　精密吸取对照品溶液，20 μl按上述色谱条件，连续进样5次，3种对照品峰面积的RSD分别为0.87%、0.58%和1.20%，表明仪器精密度良好。　　2.5  重复性实验　取同一批复方银杏叶片（20051010），按照2.2.2“供试品溶液的制备”项下依法平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测得总黄酮醇苷的含量分别为 9.10，9.18 ，9.20 ，9.03 ，9.27 mg/片，RSD为1.01 %，表明本法重复性良好。

　　2.6  稳定性实验　取同一批供试品溶液（20051010 ），按上述色谱条件于0，5，7，21，24 h进样测定并计算，总黄酮醇苷平均含量为9.16 mg/片，RSD为1.60%。结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定。

　　2.7  加样回收率实验　取已知含量的片剂（ 20051010）细粉适量，精密称定，置具塞锥瓶中，共5份，分别精密加入槲皮素、山柰素、异鼠李素混合对照品溶液10 ml（浓度分别为 0.156，0.170，0.100 mg· ml-1），按2.2.2“供试品溶液制备”项下依法操作，各进样20 μl，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。

　　表1  复方银杏叶片中银杏总黄酮醇苷加样回收率实验测定结果（略）

　　2.8  空白干扰实验  分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μl，按上述色谱条件进样测定，结果槲皮素（tR = 17.9 min）、山柰素（tR = 33.4 min）、异鼠李素（tR = 38.1 min）色谱峰与其它组分分离良好，且阴性对照在相应位置上无色谱峰，说明处方中其它成分及辅料对测定结果无干扰。色谱图见图1。

　　图1  复方银杏叶片HPLC色谱图（略）

　　2.9 样品测定　取4批样品，按2.2.2项下制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量［10］。结果见表2。

　　总黄酮醇苷=（槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量）×2.51

　　表2  样品银杏总黄酮醇苷测定结果（略）

　　3  讨论

　　取对照品溶液和阴性对照溶液分别进行紫外扫描，在200 ～ 300 nm两者均有较强吸收，在300 ～ 400 nm阴性对照溶液吸收较小，故选择在360 nm作为槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定波长。

　　实验过程中选择了甲醇水，甲醇0.4%磷酸水溶液作为流动相，并对流动相组成比例进行了选择，结果表明以“2.1”项下系统较佳，各色谱峰分离度良好，峰型尖锐，保留时间适中。

　　实验结果表明，采用上述HPLC法对复方银杏叶片中主要活性成分槲皮素、山柰素、异鼠李素等黄酮化合物的含量进行测定，方法简便、结果准确，精密度、重复性良好，处方中其它组分对银杏叶总黄酮测定无干扰，方法专属性较强，可用于复方银杏叶片的质量控制。

【参考文献】
  　　［1］潘洪平．银杏叶制剂药理作用和临床应用研究进展［J］.中国中药杂志，2005，30（2）：93.

　　［2］周海梅，周明瑞，谢秀娟．导数光谱法测定银杏叶及其提取物中的总黄酮［J］.数理医药学杂志，2003,16（2）：177.

　　［3］杨玉兰，吴龙奇，王建华.用近红外光谱检测银杏叶中的黄酮含量［J］. 河南科技大学学报，2003，23（2）：5.

　　［4］邓桂春，王鑫，赵丽艳，等．分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量［J］.辽宁大学学报，2005，32（2）：101.

　　［5］奚洪民，邹宪芝．银杏叶片中槲皮素的示波极谱法测定［J］. 中国医药工业杂志，2006，37（5）：345.

　　［6］张敏，邱朝晖，曹庸，等．荧光光度法测定银杏叶总黄酮含量的研究［J］.时珍国医国药，2005，16（3）：238.

　　［7］胡卫兵，翟万云，吴遵义，等．银杏叶中总黄酮含量的库仑滴定法［J］.化工科技，2003，11（1）：42.

　　［8］吕元琦，邬春华，袁倬斌．毛细管电泳法测定银杏叶片中橙皮素、芦丁和槲皮素［J］.化学工程师，2003，6：24.

　　［9］张蕾，陈骁鹏，董小平． HPLC法测定银杏叶胶囊的含量［J］.江苏药学与临床研究，2004，12（1）：29.

　　［10］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：597.

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