青蒿素及其衍生物一类新抗肿瘤化合物的靶点研究

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【摘要】  目的青蒿素及其衍生物是一类新抗肿瘤化合物，就近年来其作用靶点的研究做一综述。方法通过查阅近年来国内外大量相关文献。结果作用机制可能与阻滞肿瘤细胞周期，调节肿瘤细胞信号传导，诱导肿瘤细胞凋亡等靶点有关。结论青蒿素及其衍生物化学结构上有一定新颖性，抗瘤作用呈现多靶点、多环节、多效应的特点，对其抗瘤靶点及作用机制、毒副作用等进行深入研究，可能成为具有临床价值的抗癌新药。

【关键词】  青蒿素； 靶点； 分子机制

　　青蒿又名香蒿、苦蒿、蒿枝，为菊科黄花蒿属，野生，遍布全国各地,资源丰富。青蒿素 (artemisinin)首先是由我国药学工作者于20世纪70年代初从青蒿中提取的有效抗疟成分，为一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，临床上用于治疗恶性疟和脑型疟 ,是为WHO认定的全球控制疟疾流行的有效药物，也是我国唯一的具有独立知识产权的药物。蒿甲醚 (artemether)、蒿乙醚 (arteether)、青蒿琥酯(artesunate)和双氢青蒿素(dihydroartemisinin)等为其主要衍生物。1991年中国科学院上海药物研究所邓定安首先报道了青蒿素衍生物对小鼠白血病P388细胞有明显抑制作用,随后掀起了国内外学者对青蒿素及其衍生物抗肿瘤疗效和作用机制探讨的热潮。本文将从以下方面就其靶点研究综述如下。

　　1  青蒿素及其衍生物对肿瘤细胞周期的影响
     
　　THOMAS［1］研究了青蒿琥酯对肿瘤细胞的影响，各浓度药物组与对照组比较，发现其可明显影响细胞倍整时间（P=0.001 32），且将肿瘤细胞阻滞在G0+G1期，S期细胞显著减少(P=0.022 44)。又有报道［2］，青蒿琥酯作用于HL60细胞48 h后，G2+M期细胞增多。S期细胞减少，提示细胞发生G2+M期阻滞，DNA合成减少，同时亚G1期细胞增多，凋亡率增高。另见报道［3］，研究二氢青蒿素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖影响和机制时发现，1 μmol/L二氢青蒿素作用24 h后，能显著抑制MCF-7细胞增殖，细胞被阻滞在G0+G1期，S期细胞显著减少。LI［4］发现青蒿素衍生物对P388细胞的增殖抑制性，并将细胞阻滞于G1期,而诱导其凋亡。Wu［5］研究亦证实,青蒿素衍生物能将L1210及P388细胞阻滞于细胞周期中的G1期并导致细胞凋亡，细胞毒性作用更强，其机制可能不同于传统的抗肿瘤药物。
     
　　细胞周期与肿瘤的关系是近年来抗肿瘤研究的热门课题之一，近些年的研究发现，细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关，因此，有学者认为肿瘤是一类细胞周期疾病(cell cycle disease), 肿瘤细胞去分化的一个重要特征就是G1～S期卡点失常，进入S期的细胞异常增多。因此,G1期阻滞可看作细胞分化的一个判断指标。
   
　　可以肯定的是，青蒿素及其衍生物能抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞于G0+G1或G2+M期，即不同的肿瘤细胞被阻滞在不同的周期。但青蒿素及其衍生物的抗癌作用与细胞周期调控因子Cyclin D,E,CDKs和CDIs的关系，研究还较少。其如何调控细胞周期的进程，具体作用在哪个细胞周期环节，还有待进一步探讨。

　　2  青蒿素及其衍生物对肿瘤细胞信号传导途径的影响
   
　　周晋［6］通过激光共聚焦显微镜检测不同浓度青蒿素作用前后白血病细胞内钙离子的变化，显示：细胞内钙离子随药物浓度的增加而增高，随药物作用持续时间的延长而增加，同时可见到细胞凋亡。推测青蒿素可能是通过开放某些细胞膜上的离子通道，使细胞Ca2+浓度增加，活化钙调蛋白（CaM），激活磷酸二酯酶，使cAMP水解，同时又抑制腺苷酸环化酶，因此使cAMP迅速回到激活前的水平，从而阻断环腺苷酸介导的信号传导途径。另据李菌［7］报道，二氢青蒿素能有效地抑制K562细胞的增殖，同时较低浓度二氢青蒿素（2 μmol/L）能显著抑制K562细胞VEGF蛋白和mRNA的表达。Chen［8］通过对移植有人卵巢癌的裸鼠应用青蒿琥酯进行研究后发现，青蒿琥酯可以降低肿瘤细胞和血管内皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR/FIk-1的表达。Dell Eva［9］发现青蒿琥酯不仅诱导卡波济氏肉瘤细胞凋亡，而且抑制肿瘤血管的生成。青蒿素及其衍生物对肿瘤血管生成的抑制作用，可能主要与其抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和分化有关，另外与血管内皮生长因子VEGF及其受体KDR／flk-1的表达抑制亦有关。
   
　　肿瘤细胞最明显的特征就是增殖失控，而在肿瘤细胞内与生长分化有关的信号传导障碍则是增殖失控的重要因素。因此，从某种意义上说，肿瘤的发生是细胞信号传导异常的一种表现，具体地说，就是一些与细胞生长、分裂、增殖有关的信号传递通路处于异常活化或失活状态 。现有的研究表明，青蒿素类药物可以影响信号传导途径中的钙离子在胞浆的浓度，细胞内皮生长因子VEGF蛋白及其受体KDR/FIk-1和mRNA的表达等途径，作用于信号转导途径某些环节，而影响细胞的增值或分化。其作用靶点并非单独一个因子，而是各个在时间和空间上相互配合和协调。要将青蒿素类药物开发为信号传导药物，还需对所干扰的信号传导途径在肿瘤细胞是否广泛存在，以及对信号传导途径的选择性进行研究。可以预测，信号传导药物在肿瘤治疗研究中是一个非常值得开发的领域。

　　3  青蒿素及其衍生物对肿瘤细胞的凋亡机制
   
　　研究认为，青蒿素衍生物对肿瘤的细胞毒作用与其抗疟作用机理相似，由于疟原虫与肿瘤细胞具有一个共同特点：高铁浓度。而青蒿素结构中拥有独特过氧桥结构，且过氧桥结构为其药理活性所必须。实验证明青蒿素类药物是在铁元素介导下，分子内过氧桥裂解产生活性自由基发挥作用，损伤机体细胞膜结构和烷化生物大分子，诱导肿瘤细胞凋亡，且其作用与细胞内铁离子水平成正相关［10］。研究发现添加转铁蛋白能提高双氢青蒿素对人乳腺癌细胞HTB27的杀伤能力，而对正常人乳腺细胞HTB125没有明显的细胞毒作用［11］ 。国内学者［3］也发现外源添加三氯化铁150～350 μmol/L,可使双氢青蒿素对人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制率提高约30%～50%。
   
　　陈征途［12］报道青蒿琥酯对肝癌细胞HepG-2的凋亡诱导作用，从DNA梯状电泳和透射电镜观察结果来看，用青蒿琥酯处理的HepG-2 细胞可表现梯状DNA电泳区带和凋亡小体等典型的细胞凋亡特征，根据流式细胞仪检测结果，在20～80μmol/L浓度范围内，青蒿琥酯诱导HepG-2细胞的凋亡率在10% ～20%之间, 效果不如阿霉素明显。王勤等［13］研究了青蒿琥酯对小鼠H22肝癌细胞凋亡的影响，检测到Bax基因表达增加，Bcl-2基因表达减少，Bcl-2/ Bax比例下降，表明青蒿琥酯影响Bcl-2和Bax基因的表达。Bcl-2和Bax基因参与调控诱导癌细胞凋亡的P53非依赖性途径，提示青蒿琥酯诱导癌细胞凋亡与P53非依赖性途径有关。李哲［14］研究了青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡与存活蛋白(survivin protein)表达的关系，观察到暴露在不同浓度青蒿琥酯的HL-60早幼粒细胞，细胞浆内Caspase－3的活性呈浓度依赖性增强，显著高于对照组。用RT-PCR，Western Blotting技术检测到survivin mRNA和survivin蛋白均降低，推测青蒿琥酯可能通过抑制survivin蛋白表达，间接增强了肿瘤细胞内caspases蛋白酶家族成员的活性(尤其是caspase-3)，使肿瘤细胞更容易发生凋亡。
   
　　关于青蒿素及衍生物对肿瘤细胞线粒体作用的研究，董海鹰［15］用Rhodamine(Rh123)染色法检测线粒体跨膜电位的变化结果显示，青蒿素可导致K562细胞凋亡，同时线粒体膜电位下降，且呈剂量和时间依赖关系，作者认为青蒿素可通过促使肿瘤细胞线粒体的跨膜电位下降而诱导K562细胞凋亡 。聂蕾［2］研究了青蒿琥酯诱导人早幼粒白血病细胞HL60凋亡的线粒体机制，结果显示线粒体膜电位下降，Caspase酶活性增加，故可认为青蒿琥酯通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
   
　　细胞凋亡（apoptosis）是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程。长期以来，人们对肿瘤发生的研究偏重于肿瘤的生长、细胞分裂，而忽略了对细胞死亡的研究。目前的研究表明，细胞凋亡对肿瘤起负调控作用，肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖速度过快，而且与细胞死亡速率下降有关。国内外学者通过对青蒿素及衍生物近十年来的研究，在其诱导肿瘤细胞凋亡方面取得了可喜的成绩。青蒿素及衍生物抗癌谱较广，可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，且对多种耐药和转移肿瘤细胞有杀伤作用，通过产生自由基，直接损伤DNA,影响基因的表达；攻击损伤线粒体，激活相关蛋白如Caspase,survivin protein等而诱导细胞凋亡。但究竟青蒿素及其衍生物是如何诱导细胞凋亡，确切的作用靶点，目前还不是很清楚，还有待进一步研究。

　　4  其他机理
   
　　刘家军［16］以不同浓度的青蒿素作用于体外培养的K562细胞，应用流式细胞仪及Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡，TRAP—PCR—ELISA法检测细胞凋亡前后的端粒酶活性,发现青蒿素可显著降低K562细胞端粒酶活性，抑制细胞生长，诱导细胞发生凋亡，并呈现出明显的量-效与时-效关系，降低细胞端粒酶活性可能是其重要作用机制之一。Lee［17］通过研究结构－功效关系指出，青蒿素的抗肿瘤作用可能是其与肿瘤细胞内特殊的靶蛋白受体结合的结果。林芳［18］在诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验中证明了这一观点，对青蒿素骨架上12-C上内酯环的羰基(第12位上)进行衍生化处理后的青蒿琥酯，对肿瘤细胞的抑制作用比青蒿素明显增强。另外，还有研究发现［19］，青蒿素可以抑制诱导性的NO合酶的合成及NF-KB的激活。而在相对低浓度的NO,肿瘤生长、增殖和血管发生都被促进［20］。

　　5  展望
   
　　目前对恶性肿瘤的药物治疗以化学药品为主，但化学药品的开发费用昂贵，毒副作用大，多有不同程度的致突变毒性，病人常难以承受。因此，人们把目光转向中药，试图从天然植物成分中寻找毒副作用小、作用独特的抗肿瘤药物。　青蒿素及其衍生物为一类含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，在化学结构上有一定新颖性，其抗瘤谱广，毒副作用小，可以逆转肿瘤多药耐药，与传统化疗药物不存在交叉耐药现象［1］,且其成本较低，预示可能成为具有临床价值的抗癌新药。 目前的研究显示，青蒿素及其衍生物抗瘤呈现出多靶点，多环节，多效应的特点。但有些问题还不是很清楚，如其诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、影响信号传导的研究大部分停留在对现象的观察及个别指标的检测上，其确切作用靶点，作用的各个环节，以及各环节之间如何的调控等研究及对其体内抑瘤实验研究的资料也较少。就其逆转多药耐药方面， Oliver Burk［21］发现一有趣的现象，青蒿素可以诱导LS174T细胞和肝细胞的CYP3A4和MDR1(多药耐药性基因)mRNA的表达，同时又抑制MDR1编码的蛋白Pgp(具有能量依赖性药物流出泵功能的跨膜蛋白)活性。还有其毒副作用方面，有报道指出，在体外细胞培养中，青蒿素对鼠大脑皮层细胞短期作用有轻微损伤，但可导致脑干细胞发生不可逆变性［22］。以上这些问题都有待于我们继续探讨。
【参考文献】
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