川芎嗪对免疫性肾损伤大鼠肾脏形态及功能的影响

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  作者：谭洪华，李霞，薄爱华，邢立强， 薛贵平

【摘要】  目的探讨中药川芎嗪对免疫性肾损伤大鼠肾组织形态及功能的影响。方法猪血清复制大鼠肾损伤动物模型，川芎嗪注射液治疗4周。观察肾小球毛细血管基底膜厚度、系膜增生等形态学改变以及尿蛋白与血清MDA含量、SOD活性的变化。结果模型组基底膜厚度明显大于正常组（P<0.01），川芎嗪组明显低于模型组（P<0.05），明显减轻肾脏病理形态损害。川芎嗪组和模型组比较大鼠尿蛋白、血清MDA含量明显下降（P<0.01）；SOD活性明显升高（P<0.01）。结论 川芎嗪可以明显改善免疫性肾损伤大鼠肾脏病理形态和功能，减少尿蛋白，对抗自由基引起的脂质过氧化损伤。

【关键词】  川芎嗪； 免疫性肾损伤； 形态学； 大鼠

　　The Effects of Tetramethylprazine on Nephritic Morphology and Function of Immune Renal Injury in Rats

　　Abstract：ObjectiveTo study experimentally the effects of tetramethylprazine on nephritic morphology and function of immune renal injury in Rats.MethodsRats were administrated intra-abdominally fresh swine serum for 8 weeks to induce immune renal injury disease. Treated group was administrated intra-abdominally tetramethylprazine injection for 4 weeks. Hyperplasia of glomerulus basement membrane and the thickness of mesangium were determined under light microscope and by image analyzer, and it was tested for changes of the content of urinary protein(UP), maleic dialdehyde(MDA) and activity of superoxide dismutase(SOD).ResultsCompared with model group, the hyperplasia degree of mesangium and basement embrane were obviously inhibited, and the content of UP obviously decreased; MDA of serum was lowered and the serum SOD activity was markedly raised among rats of treating group(P＜0.01).ConclusionTetramethylprazine can markedly improve the model rats' nephritic morphlology and function, eliminate proteinuria, raise the serum SOD activity and lower the content of serum MDA.

　　Key words：Tetramethylprazine;  Immune renal injury;  Morphology；  Rats
   
　　川芎嗪（Tetramethylpyrazine,TMP）［1］是从具有“祛风止痛，行气开郁，活血通脉，燥湿除痹”功能的中药川芎中分离的有效成分, 是一种具有钙通道阻滞作用的生物碱单体，其化学结构为四甲基吡嗪，现已能人工合成。目前中医临床利用川芎嗪治疗肝、肾疾病的经验已较丰富，尤其是对肾病的治疗已取得较好效果，其治疗机制的研究报告甚少。为了探讨川芎嗪治疗肾病的机制，我们采用免疫性肾损伤动物模型，经川芎嗪治疗观察大鼠肾小球形态变化、尿蛋白和血清MDA、SOD变化，为阐明川芎嗪治疗肾病机制提供科学依据。

　　1  材料

　　1.1  动物Wistar大鼠48只，雌雄并用，分笼饲养，体重150～175 g，由河北医科大学实验动物中心提供。适应性喂养7 d，用代谢笼留取尿液，尿常规检验定性为阴性者用于实验。

　　1.2  药品与试剂盐酸川芎嗪注射液，40 mg/2 ml，北京市永康药业有限公司生产（批号20020731）；丹参注射液，40 mg/2 ml，哈药中药二厂生产（批号20020615）；Epon 812 ，OsO4（锇酸）日本进口分装；醋酸双氧铀、柠檬酸铅河北北方学院电镜室配制；磺基水杨酸分析醇成都化学试剂厂生产；MDA，SOD测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。

　　1.3   造模剂制备取新鲜猪血液(张家口市生猪定点屠宰厂宰杀现场获取)，3500 r/min离心制备血清，紫外线消毒，分装于5 ml安瓿内,-30℃保存备用。

　　1.4  仪器JEM 100 CXⅡ型电子显微镜，日本生产；NOVA 4型超薄切片机，瑞典生产；722型分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；日立H100型尿液自动生化分析仪，日本生产；ZP8型计算机图像分析系统，北京凌志公司生产。

　　2  方法

　　2.1   动物模型制作取制备好的新鲜猪血清，参照猪血清注射法［2］及血清病肾炎模型［3，4］复制免疫性肾损伤模型：鲜猪血清0.7 ml腹腔注射2次/周，连续8 周，尿蛋白定性为（++）以上者确定为肾损伤大鼠模型。

　　2.2  分组与用药大鼠随机分为正常组、模型组、丹参对照组和川芎嗪治疗组，各12只动物。从第9周开始，正常组和模型组动物改为生理盐水0.4 ml/kg，腹腔注射，1次/d；后两组分别腹腔注射丹参注射液和川芎嗪注射液治疗，0.4 ml/kg，1次/d，共治疗4 周。

　　2.3  指标测定各组大鼠分别在造模前、造模后、治疗后测定24 h尿蛋白含量（磺基水杨酸比浊法）；在造模前、造模后、治疗后断尾取血测定MDA含量和SOD活性，严格按照试剂盒说明测定；治疗结束后取肾组织常规制作石蜡及电镜切片；光镜下观察，用图像分析仪测量定量分析基底膜和系膜基质增生后宽度。

　　2.4   统计学处理全部实验数据以±s表示，组内前后比较用t检验，组间比较用单因素方差分析，所用统计软件为SPSS10.0。

　　3  结果

　　3.1  川芎嗪对大鼠肾脏形态改变的影响光镜下正常组肾小体呈球形，血管球内皮细胞和系膜细胞不易区分，肾小囊腔宽窄比较均匀，基底膜均匀，无增厚；模型组肾小球基底膜普遍增厚，系膜细胞和基质增生，连同增厚的基底膜压迫甚至闭塞毛细血管腔，其间常有数量不等的中性粒细胞浸润，上皮细胞增生，形成新月体，肾小体毛细血管充血；川芎嗪组基底膜轻度增厚、系膜基质轻度增生，毛细血管管腔变窄不明显，各部分结构清晰；丹参对照组基底膜和系膜基质轻度增生，毛细血管腔变窄。电镜下模型组肾小球内皮及上皮细胞显著肿胀变性，内质网扩张，形成大空泡，基底膜增厚或厚薄不一，在基底膜表面呈驼峰状或小丘状隆起，足突融合，局部裂孔消失，膜下可见电子密度高的沉积；川芎嗪组肾小球血管内皮细胞及足细胞水肿消失，足突及裂孔较清晰，驼峰消失，但仍有基底膜厚薄不一的现象；丹参对照组肾小球内皮细胞局部水肿，基底膜厚薄均匀。3.2  川芎嗪对大鼠肾脏系膜及基底膜的影响见表1。模型组系膜增生显著高于正常组（P<0.01），丹参组、川芎嗪组比模型组减轻（P<0.05），模型组基底膜厚度明显大于正常组（P<0.01），丹参组、川芎嗪组均低于模型组（P<0.05）。表明川芎嗪对肾小球系膜和基底膜增生具有一定抑制作用。

　　表1  各组大鼠肾脏系膜基质增生及基底膜厚度的变化（略）

　　与正常组比较，*P<0.01;与模型组比较，△P<0.05；n=12

　　3.3   川芎嗪对大鼠尿蛋白的影响见表2。模型组大鼠尿蛋白含量显著高于正常组（P<0.01），丹参组、川芎嗪组治疗后尿蛋白含量显著低于模型组（P<0.01）。

　　表2  各组大鼠不同时期的尿蛋白定量变化（略）

　　与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01; 与治疗前比较，▲P<0.01

　　3.4   川芎嗪对大鼠血清MDA和SOD的影响见表3～4。模型组的血清MDA含量显著高于正常组（P<0.01），丹参组、川芎嗪组治疗后MDA含量显著低于模型组（P<0.01）。模型组的血清SOD活性较正常组明显降低（P<0.01），丹参组、川芎嗪组治疗后SOD活性较模型组明显升高（P<0.01）。

　　表3  各组大鼠不同时期的血清MDA含量变化（略）

　　与正常组比较，*P<0.05, **P<0.01; 与模型组比较，△P<0.01;与治疗前比较，▲P<0.01；n=12

　　4   讨论  
   
　　肾小球的滤过膜在生理状态下对滤过物质的分子大小具有选择性。蛋白质几乎不能通过。当致病因素引起肾小球病变时，都会影响滤过膜的屏障作用，通透性增加，使大分子物质得以通过，从而导致蛋白尿大量漏出。本实验在电镜下可见模型组肾小球基底膜两侧上皮细胞下或内皮细胞下电子致密物沉积，有的在基底膜表面呈驼峰状。沉积物表面的上皮细胞足突融合、局部裂孔消失。基底膜不规则增厚，部分变薄有裂孔或缺损。川芎嗪治疗组肾小球内皮细胞及上皮细胞结构明显恢复，足突及裂孔清晰，驼峰样结构大部分消失，但基底膜仍有厚薄不一的现象。说明川芎嗪有助于肾小球滤过膜功能的恢复，对肾小球滤过屏障的损伤的修复有促进作用，并能够促进上皮细胞的再生与修复。川芎嗪对大鼠肾小球滤过膜的修复作用是其治疗免疫性肾损伤、消除蛋白尿的重要机理之一。

　　表4  各组大鼠不同时期的血清SOD活性变化（略）

　　与正常组比较，*P<0.01; 与模型组比较，△P<0.01；与治疗前比较，▲P<0.01；n=12
   
　　免疫性肾损伤是免疫复合物介导的炎症反应，除与淋巴因子，溶酶体成分释放有关外，还与氧自由基参与有关。自由基引起的脂质过氧化损伤在免疫性肾损伤中起很大作用。川芎嗪可减轻蛋白尿而减少锌及铜的丢失，提高血清及肾组织的锌铜含量，从而增强SOD的活性，又可提高血钙及组织中镁含量，降低血清Mg2+及组织内Ca2+的含量，提高组织内Mg/Ca比值，从而减轻肾组织损伤。实验结果表明，模型组大鼠SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，而经川芎嗪治疗后，SOD活性明显升高，MDA含量明显降低，说明川芎嗪能有效地提高血清SOD活性，减少血清MDA含量，加强对活性氧自由基的清除作用，从而减轻肾小球及肾小管上皮细胞膜的脂质过氧化损伤。吴升华等［5］研究显示，血清MDA与尿蛋白呈正相关关系，改善自由基代谢也有利于尿蛋白含量的降低。本实验治疗前后病理变化为，电镜下模型组大鼠肾小球的病变明显，上皮下有电子致密物沉积及基底膜增厚、断裂、足细胞足突融合，肾小球的滤过膜损伤严重；川芎嗪治疗组大鼠肾小球的病变不明显，上皮下无电子致密物沉积，基底膜厚度基本均匀一致，未见足细胞足突融合。这一结果也证明了川芎嗪能够对抗自由基引起的脂质过氧化损伤，保护肾小球滤过膜，减轻蛋白尿，对免疫性肾损伤有良好的疗效。
   
　　总之，本实验研究提示川芎嗪能明显改善免疫性肾损伤大鼠一般状态，对免疫性肾损伤大鼠滤过膜有保护作用，可减少尿蛋白，对抗自由基引起的脂质过氧化损伤，显著提高血清SOD活性，减少MDA含量，明显改善肾小球的病理形态学改变。

【参考文献】
  　　［1］ 王 昕，陈信义.川芎嗪对肿瘤细胞影响研究概况与展望［J］．中国中药杂志，2003，28（4）：295.

　　［2］ 于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模型的比较［J］．实验动物科学与管理，1995，12（4）：5.

　　［3］ 贾 慧，邹万忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性肾炎模型的建立［J］．肾脏病与透析肾移植杂志，1996，5（3）：21.

　　［4］ Yamamoto T，Kihara I，Morita T，et al.Bovine serum albumin(BSA) nephritis in rats.I.Experimental model［J］．Acta Pathol Jpn，1978，28（6）：859.

　　［5］ 吴升华，杨运昌，王兆铭. 活性氧在ARD肾病中致病作用的实验研究［J］．中国病理生理杂志，1991，7（3）：306.