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作者：廖晓慧 孙海燕 刘冬 彭光华 张声华
【摘要】 目的建立反相高效液相色谱（RPHPLC）测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的方法，为其深入研究提供方法学基础。方法采用Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），Aydac保护柱，柱温30℃ ，以乙腈∶水(22∶78) ，0.05%TFA为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长215 nm，参考波长350 nm，进样量20 μl。结果该方法使降血压肽与其它相似产物得到较好分离，在5～250 μg/ml内线性关系良好，r=0.999 8，最低检测限达8 ng，低、中、高浓度下的加样回收率、日内、日间精密度均符合方法学要求。结论 该方法稳定、灵敏度高、操作简便、适用于重组降血压肽的含量测定。
【关键词】 重组大肠杆菌； 降血压肽； 反相高效液相色谱
Abstract：ObjectiveA simple and rapid reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed for the AHP in Recombinant E.coli fermentation broth.MethodsThe separation conditions were: Aydac C18 reversed phase column, Aydac guard column. Mobile phase was acetonitrile∶water(22∶78),0.05%TFA,flow rate 1ml/min.The detection wavelength was 215nm,reference wavelength was 350 nm.Column temperature was 30℃.Injection volume：20 μl. ResultsAHP has good separation from other components in fermentation broth. And there was perfect linear correlation between 5～250 μg/ml, r=0.999 8. The limit of detection was 8ng. The intra-and inter-assay precisions, recovery met the methodology requirements.ConclusionThis method had high precision,high accuracy and was easy-manipulated. This method proved to be suitable for AHP.
Key words：Recombinant E.coli; Antihypertensive peptide; RP-HPLC
降血压肽（antihypertensive peptide，AHP）是一类能够降低人体血压的小分子多肽。它通过抑制RAS系统的ACE活性而降低血压。降血压肽来源于天然动、植物及微生物，具有降血压效果明显、无毒副作用等优点。因此，已成为目前抗高血压药物研究的热点之一［1～3］。
利用基因工程生产降血压肽，克服了直接从动植物、微生物原料中分离提取降血压肽筛选水解酶类的盲目性（特异性蛋白水解酶事先选定），以及纯化工艺的复杂繁琐性，而且不受原料来源的限制，生产周期短，下游分离纯化工艺简单，除具有高效表达外源蛋白的能力、完善的翻译后加工机制外,还能在常规条件下进行高密度培养,有利于工业化生产。
RPHPLC的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析。对于分子结构比较简单的多肽和某些蛋白质,在不影响产物的活性或产物在RPHPLC后很容易重新折叠复性的前提下,用RPHPLC进行纯化制备是一项高效的手段。同时,RPHPLC分辨率高和重复性好的特点,使它在蛋白质及多肽分析领域占据核心地位。
1 器材
1.1 仪器高效液相色谱仪Agilent 1100，自动进样器Agilent 1100，二极管阵列式检测器Agilent 1100，系统控制器Agilent 1100，色谱工作站Agilent1100，均为美国Agilent公司出品；分析柱Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Aydac公司；保护柱（guard column），美国Aydac公司；高速离心机Centrifuge 5810R，德国eppendorf公司；一次性针头式过滤器0.45 μm，美国millipore公司。
1.2 试剂降血压肽标准品由上海华大天源生物科技有限公司按LysValLeuProValPro氨基酸序列合成，纯度≥95%；发酵样品由深圳市发酵精制重点实验室制备；乙腈HPLC级，天津协和昊鹏色谱科技有限公司；三氟乙酸（TFA）HPLC级，美国sigma公司。实验用水均为18.2Ω超纯水。
2 方法
2.1 标准储备液的配制精密称取0.020 0 g标准品，溶于超纯水中，定容至10 ml容量瓶中，即得2 mg/ml标准储备液。
2.2 发酵样品的处理发酵液经离心，收集菌体细胞，破碎，亲和层析，酶切等分离、纯化过程而得，经0.45 μm滤膜过滤，HPLC进样。
2.3 色谱条件色谱柱：Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Aydac保护柱；流动相：乙腈∶水(22∶78)，0.05%TFA；流速：1.0 ml/min；检测波长：215 nm，参考波长350 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl 。
2.4 标准曲线的制定取2.1项下配制的标准储备液分别稀释成250，100，50，20，10，5 μg/ml标准溶液，0.45 μm滤膜过滤，20 μl进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归。
2.5 精密度实验
2.5.1 日内精密度取100，50，20 μg/ml的标准溶液，1 d内分别连续进样6次，计算RSD（%）。
2.5.2 日间精密度取100，50，20 μg/ml的标准溶液，分别于6 d进样（n=3），计算RSD（%）。
2.6 回收率实验采用标样添加法，取100，50，20 μg/ml 3个浓度的发酵液分别添加浓度为50 μg/ml的标准液至理论值分别为150，100，70 μg/ml进样测定，测定峰面积，计算回收率。
3 结果
3.1 色谱行为考察本实验选择水加乙腈作流动相，TFA作阴离子对试剂，针对不同的乙腈和TFA浓度及洗脱速度对降血压肽的洗脱峰形、分离效果进行研究。研究表明，影响分离度的因素主次依次为乙腈浓度>TFA浓度>洗脱速度。从相邻峰的分离度和缩短分析时间综合考虑，最终优化条件为乙腈浓度22%，TFA0.05%，洗脱速度1 ml/min。AHP的保留时间为4.15～4.20 min之间。标准品与样品的色谱图如图1～2。
图1 降血压肽标准品色谱图（略）
图2 发酵样品中的降血压肽色谱图（略）
3.2 线性考察及最低检测限以250，100，50，20，10，5 μg/ml为标准系列溶液，0.45 μm滤膜过滤，20 μl进样，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得标准曲线如图3。实验表明， 5～250 μg/ml范围内呈现良好的线性关系。r=0.999 8。 图3 降血压肽标准曲线（略）
当进样浓度为0.4 μg/ml，S/N =3即最低检测限为8 ng。
3.3 精密度日内、日间精密度结果如表1所示。RSD在0.0071%～0.0812%之间。
3.4 加样回收率取100，50，20 μg/ml 3个浓度的发酵液分别添加浓度为50 μg/ml的标准液至理论值分别为150，100，70 μg/ml进样测定。结果见表2。
3.5 样品测定分别取3个批次的发酵液，经样品处理，按上述方法测定其中的降血压肽含量，结果如表3所示。
4 讨论
迄今为止，日本是研究AHP最多的国家，早在20世纪80年代就对降血压肽进行了广泛的研究，采用各种廉价的原料蛋白开发了多种ACE抑制肽功能因子添加到食品中，取得了很好的经济社会效益。我国在AHP方面的研究，前景非常喜人。建立一套适宜的分离分析技术，是将降血压肽推向商业化生产的关键，分离提取的效率也会直接影响到它的应用前景。降血压肽的分离分析甚至结构鉴定是一项最复杂，也是最有意义的工作。
表1 降血压肽的精密度（略）
表2 降血压肽的回收率（略）
表3 发酵样品中AHP含量的测定（略）
基因工程技术的发展及蛋白质研究的不断深入，必然需要灵敏、快速、准确的分析方法的支持。肽和蛋白质在溶液中的扩散系数比较小，黏度大，外界温度、介质的pH值、有机溶剂性质等会导致其结构改变，产生变性。而RP-HPLC的溶解能力较大且RP-HPLC柱效高、分离能力强、保留机理清楚，与其它色谱方法相比，具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势，对于肽和蛋白质的分离分析，RP-HPLC正受到越来越多的关注［4～6］，非常适合于发酵液这种复杂体系中降血压肽的定量分析，也为其他小分子肽类物质的定量分析提供了有效的科学依据。并且对推动我国多肽类保健食品、药品的产业化具有重要意义。
由于RP-HPLC较高的分辨率及独特的选择性，作为一种蛋白质及多肽的分离分析手段已越来越得到人们的认可，并用于许多新兴领域如蛋白质组的分析。多种联用技术如RP-HPLC质谱、RP-HPLC毛细管电脉及RP-HPLC生物传感器的出现也使得更加快速的在线分析成为可能，实现了对样品各成分分子量、纯度及活性等的实时分析。相信随着对RP-HPLC分离机理研究的逐步深入、分离体系的不断完善及各种检测手段如质谱技术的快速发展，反相液相色谱法必将在蛋白质及多肽研究领域得到更加广泛的应用。
【参考文献】
［1］ Yamamoto N.Antihypertensive peptide derived from food proteins.J Biopolymers［J］.1997,47:119.
［2］ Yamamoto N,Ejiri M,Mizuno S.Biogenic peptides and their potential use［J］.Curr Pham Des,2003,9:1345.
［3］ Yoshikawa M,Fujita H,Matoba N,et al.Bioactive peptides derived from food proteins preventing lifestyle-related diseases［J］.Biofactors,2000,12:143.
［4］ 张玉奎.现代生物样品分离分析方法［M］.北京：科学出版社，2003：11.
［5］ 朱晓囡，苏志国.反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用［J］.分析化学，2004，32（2）：248.
［6］ 陆静宁，刘景晶，姚 忠.高效液相色谱法对重组人甲状旁腺素相关肽的研究［J］.现代生物医学进展，2006，6（4）：28. |
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发表于 2014-8-17 22:40:05
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