高效液相色谱法测定氢醌脂质体的含量及包封率

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          作者：张春娜，王小丽，曾昭武

【摘要】  目的制备氢醌脂质体并测定含量及包封率。方法采用蒸发超声法制备氢醌脂质体,高效液相色谱（HPLC）法检测氢醌含量及包封率。结果色谱条件下氢醌与辅料、溶剂峰分离良好，氢醌在5.0～50.0 μg/ml范围内线性关系良好。3组氢醌脂质体包封率分别为83.26%,89.13%,80.75%。结论氢醌脂质体制备工艺可行,质量控制方法简单、准确。

【关键词】  氢醌； 脂质体； 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo prepare and determine the content and entrapment efficiency of Hydroquinone liposome.MethodsHydroquinone liposome was prepared by evaporating and ultrasound method, determined the concentration and the entrapment efficiency of Hydroquinone liposome by HPLC. ResultsHydroquinone had a good linear relationship in a range of 5.0 ～50.0 μg/ml. The entrapment efficiency of Hydroquinone liposome in three groups reached 83.26%, 89.13%, 80.75% respectively.ConclusionThe technology of preparing Hydroquinone liposome was feasible and the method of quality control was simple and accurate.

　　Key words：Hydroquinone;  Liposome;  HPLC
   
　　氢醌制剂临床上主要用于治疗色素性皮肤病，如黄褐斑、雀斑、黑变病、炎症后色素沉着等，是一种有效的临床药物［1，2］。国内制剂氢醌霜，化学性质不稳定，易氧化变色，限制了其应用［3］。笔者制备了氢醌脂质体制剂，以期达到促进皮肤渗透,防止氧化，减少不良反应等目的。

　　1  试剂与仪器
   
　　紫外可见分光光度计（美国Biogate公司）；高效液相色谱仪,色谱C18柱(4 μm, 150 mm ×3.9 mm) (日本岛津公司)；超声波分散仪(Meico Fisher Scientific公司)；冷冻真空干燥机(美国LABCONCO公司)；激光粒度分析仪(英国马尔文公司)；恒温磁力搅拌器(金坛市富华仪器有限公司)；电子天平(湖南湘仪医疗器械厂)；旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂）；循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；高速搅拌机（IKA WERKE公司）。
   
　　大豆卵磷脂(纯度>95% ,上海化学试剂公司) ,胆固醇(上海化学试剂公司) , 氢醌对照品(甲醇精制，铈量法测得含量达99.8%) , 氢酯原料药(沈阳市试剂五厂) ,葡聚糖凝胶G－50 (上海化学试剂公司，进口分装) ,甲醇(江苏汉邦有限责任公司，色谱纯),曲拉通X-100（上海化学试剂公司），乙醚（上海化学试剂公司，分析纯），三蒸水（自制）。

　　2  方法与结果

　　2.1  配方设计与制备方法氢醌脂质体以磷脂和胆固醇为膜材,加入三蒸水终体积为10 ml。将氢醌原料药、磷脂、胆固醇按比例混匀,再加入适量乙醚溶液充分溶解,真空减压,去除有机溶剂,得均匀干膜。加入三蒸水,在25℃下高速搅拌,充分水化,获得粗脂质体。然后将获得的样品,转入超声波乳化器,在一定超声强度下持续超声10 min,得到粒径均匀的脂质体,充氮气，分装，真空冷冻干燥。

　　2.2  色谱条件与系统适应性色谱柱为C18柱，以甲醇：水( 1∶3) 为流动相,柱温为室温，检测波长为280 nm ,流速为0.8 ml/min，进样量为20 μl。采用外标法。在选定的色谱条件下,以氢醌计算理论塔板数为7 622,符合《中国药典》高效液相色谱分析方法的要求。

　　2.3  色谱行为取氢醌对照品溶液、空白脂质体破乳溶液（破乳采用曲拉通X-100）和氢醌脂质体各20 μl进样分析，得色谱图1～3。由图可见，氢醌的保留时间约为6.3 min，空白脂质体只在5 min以前有色谱峰，表明辅料对氢醌的测定无干扰。

　　图1  空白脂质体色谱图（略）

　　图2  氢醌对照品色谱图（略）

　　图3  氢醌脂质体色谱图（略）

　　2.4  标准曲线　取干燥至恒重的氢醌对照品50 mg ,精密称定,置50 ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。精密量取对照品溶液0.5 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 和5.0 ml,分别置100 ml量瓶中,各三蒸水稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件,进样20 μl/次,实验结果表明,当氢醌在5～50 μg/ml的浓度范围内,以对照品峰面积 (Y) 为纵坐标,对照品浓度(X) 为横坐标作图, 得一直线。回归方程为Y=2 920.6X+17.8072,r=0.992 7。

　　2.5  精密度测定取上述浓度为5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 μg/ml的氢醌对照品溶液, 于1d和1周内重复进样5次，进样量为20 μl，测定日内精密度和日间精密度。日内差异RSD为0.92% (n=5), 日间差异RSD为1.01 %(n=5)。

　　2.6  回收率测定按处方比例加入0.5 ml空白脂质体混悬液至1～5号100 ml棕色容量瓶中，依次准确加入氢醌对照品贮备液0.5 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 和5.0 ml，加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀即得浓度范围为5～50 μg/ml的样品溶液,分别进样20 μl,测定峰面积，连续5次，计算回收率,结果平均回收率为97.58%(n =6) ,RSD为0.75 %。　2.7  脂质体中氢醌的含量测定精密吸取氢醌脂质体0.5 ml(相当于氢醌0.5 mg),置于25 ml棕色容量瓶中,曲拉通X-100破乳,加入流动相稀释对刻度,摇匀,作为供试液;准确配制浓度为20.0 μg/ml的氢醌对照品溶液。取上述溶液各20 μl进行分析，记录色谱图。按外标法计算出供试品中氢醌的含量。不同批号氢醌脂质体中药物含量测定结果见表1。

　　表1  含量测定结果（略）

　　2.8  氢醌脂质体包封率的测定取氢醌脂质体100 μl于5 ml褐色容量瓶,补充甲醇至刻度,摇匀, HPLC测定药物含量,乘以稀释倍数即得全药浓度。取相应氢醌脂质体1 ml,采用葡聚糖G-50凝胶柱,以蒸馏水为洗脱液,流速1 ml/min,过滤分离氢醌脂质体及游离氢醌,收集所有氢醌脂质体准确测量其体积, HPLC测定药物含量。包封率（%）=（C脂/C总）×100%。测定3个批号脂质体的包封率分别为83.26%,89.13%,80.75%。

　　2.9  氢醌脂质体粒径大小测定室温下用激光粒度仪测定其平均粒径,入射角度90°,设定样品温度为25℃时进行测量,每个样品连续测量3次。测得氢醌脂质体粒径均匀,粒径为(220±35)nm。

　　3  讨论
   
　　自20世纪60年代脂质体作为药物载体应用以来,目前世界上已有多个脂质体制剂得到批准应用。本研究采用蒸发超声法制备的脂质体粒径均匀,分布范围窄,药物含量稳定,包封率达80%以上。由于氢醌极不稳定,所有操作最好在暗室中进行,实验中使用棕色容器,且避免高温。冻干时加用海藻糖作为保护剂。氢醌制剂含量测定采用铈量法和紫外分光光度法,但操作繁琐费时,本研究采用高效液相色谱测定法,通过提高流动相中水的比例,使保留时间延长,由于色谱柱的差异,可适当调整流动相的比例,以满足含量测定的要求。此法可用来测定本品含量,结果准确可靠,重现性好。

【参考文献】
  　　［1］ 王建华，雷 帆，崔景荣. 20种中药对酪氨酸酶抑制作用的研究［J］.中国药学杂志，2000,35(4):232.

　　［2］ 许建波，张 琳，武云霞.3%复方氢醌乳膏治疗黄褐斑临床观察［J］.中国美容医学， 2006，15(4)：448.

　　［3］ 闫 军，李昌生.氢醌霜的制备及质量控制［J］.中国医院药学杂志，2004，24(2):112.