|
|
【摘要】 目的制订拳参的含量测定方法。方法采用高效液相法测定拳参中没食子酸的含量。结果没食子酸在0.050 7～0.608 4 μg范围内呈良好的线性关系。平均加样回收率为100.212%，RSD为3.6%。结论此方法简便准确，专属性强，建立的方法能有效地控制拳参的质量。
【关键词】 拳参； 没食子酸； 高效液相色谱法
拳参为蓼科蓼属多年生草本植物拳参Polygonum bistorta L.的干燥根茎。始载于《神农本草经》，称为紫参，列为中品。该药材具有清热解毒，凉肝熄风，消肿止血的功效。临床上用于赤痢，热泻，肺热，咳嗽，痈肿，瘰疬，口舌生疮，吐血，衄血，痔疮出血，毒蛇咬伤的治疗［1］。《中国药典》2005年版拳参项下，对其质量控制确定了性状、显微鉴别和薄层鉴别。因此，本实验利用高效液相色谱法对有效成分的含量测定进行了研究。以期完成质量标准，有效、全面地控制拳参的质量。
拳参的根茎中主要含可水解鞣质15%～25%，缩合鞣质β谷甾酸类等。可水解鞣质水解后生成没食子酸（gallic acid）和糖（或多元酚）。没食子酸的化学名：Benzoic acid,3,4,5-trihydroxy- 。分子式：C7H6O5。为针状结晶（无水甲醇或氯仿），熔点235～240℃。结构式如下：
测定鞣质含量的方法很多，有氧化还原法、络合量法、比色法、皮粉法及高效液相色谱法［2］。由于鞣质是一种复杂多元酚混合物，不同鞣质组分均同具有多元酚的特性，不易分离提取为单体。在提取分离过程中，鞣质可发生氧化、聚合、离解等反应而改变其原有的状态，故难以定量。目前多采用测定没食子酸的含量作为检测指标。没食子酸含量测定方法有薄层层析—紫外分光光度法、薄层扫描法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等。根据这些方法操作复杂性、测定的准确性、重现性和精密度，本实验选用高效液相色谱法来测定拳参中游离没食子酸的含量。此方法简便、快速，结果准确，重现性好。
1 仪器与试药
Agilent 1100 series美国AGILENT公司：Hypersil ODS（25 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱；TG332A微量分析天平仪，湘仪天平仪器厂；0.45 μm微孔滤膜。
没食子酸对照品，中国药品生物制品检定所（批号0831-9501）；甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；重蒸馏水。药材为市售，产地英山、麻城。
2 方法与结果
2.1 提取条件的选择实验
2.1.1 溶剂的选择鞣质极性强，可溶于有机溶剂中，不溶于极性小的溶剂，微量水的存在可增大鞣质的溶解度［3］。根据其特征，本实验在提取没食子酸的过程中，采用极性大的溶剂甲醇。
2.1.2 溶剂浓度选择实验称取相同量的样品，用不同浓度甲醇（ 100%,70%,50%）回流提取2 h，按照实验选择的色谱条件测定没食子酸含量。结果提取的含量分别为2.61，2.52，2.66 mg/g。50%甲醇提取的含量最高。因此，本实验选择50%甲醇溶液。
2.1.3 提取方式选择实验称取相同量的样品，加入50%甲醇溶液，通过加热回流2 h，温浸（40～50℃）4 h，超声处理20 min3种不同方式提取，按照实验选择的色谱条件测得结果分别为2.748，2.553，2.749 mg/g。根据实验结果和实际操作情况，本实验采用超声提取方法。
2.1.4 超声提取时间实验称取相同量的样品，加50%甲醇溶液进行不同时间（15，20，30，40 min）超声提取。测得结果分别为3.14，3.04，3.50，2.92 mg/g。超声30 min后含量达到最高，且稳定。因此，本实验选择超声处理30 min。
2.1.5 色谱条件选择实验通过紫外分光光度仪测没食子酸的最大吸收波长为261 nm，故选择测定波长为261 nm。见图1。采用C18柱，以甲醇水乙腈磷酸溶液不同比例的筛选，用甲醇-水-磷酸（2∶98∶0.05）的流动相时，测得没食子酸的色谱峰形对称，分离效果好。因此，选择该比例的流动相进行测定。柱温的高低和流速的好慢，可直接影响分离效果，经试验选择柱温为30℃，流速为1.000 ml/min。在此色谱条件下，没食子酸色谱峰的对称性、分离度均能满足测定要求。色谱图见2～3。 图1 没食子酸的紫外图谱（略）
图2 没食子酸对照品色谱图（略）
2.2 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品（经五氧化二磷干燥恒重）15.84 mg，置25 ml的量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度。精密吸取上述溶液2 ml，置25 ml量瓶中加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。
2.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过2号筛）0.5 g，精密稳定，置50 ml量瓶中，加50%甲醇30 ml，超声处理30 min，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀。用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
图3 样品拳参的色谱图（略）
2.4 线性关系考察精密吸取上述没食子酸对照品溶液1，2，3，6，9和12 μl，按上述色谱条件进行色谱分析，测定色谱峰面积。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表1。
表1 线性关系考察（略）
结果表明，没食子酸在0.050 7～0.608 4 μg之间呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验取本品粉末（过2号筛），按溶液制备项下提取，按上述色谱条件重复进样5次，测得色谱峰面积。结果见表2。
表2 精密度实验（略）
结果表明,本方法精密度良好。
2.6 稳定性实验取供试品溶液，照上述色谱条件，间隔不同时间进行测定，共测定5次。结果见表3。
表3 稳定性实验（略）
结果表明，样品溶液在测定的160 min RSD为0.3%，方法稳定，可满足实验要求。
2.7 重现性实验取同一批号本品粉末（过2号筛）5份，按溶液制备项下提取，按上述色谱条件进行含量测定，并对所得数据进行处理。结果见表4。
表4 重现性实验（略）
结果表明，方法的重现性良好。
2.8 加样回收率实验精密称取已知含量的本品粉末（过2号筛）0.5 g共5份，置50 ml的量瓶中，精密加入没食子酸的对照品1.267 2 mg，分别按供试品溶液制备项下提取，按上述色谱条件进行测定并进行数据处理。结果见表5。
表5 回收率实验（略）
结果表明，平均回收率为100.2%，RSD为3.6%。
2.9 样品测定精密称定不同批号本品粉末（过2号筛）0.5 g，按照供试品溶液制备法制备，在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和样品溶液10 μl注入高效液相色谱仪，依法测定。结果见表6。
表6 样品测定（略）
3 讨论
目前，对拳参的化学成分研究文献报道的很少。而在现行的拳参质量标准中，尚未确定拳参含量测定方法。因此，本实验研究从拳参中提取出没食子酸，通过实验表明没食子酸为拳参中可控成分之一，故将其作为药材中的指标性成分进行含量测定，有效地控制拳参的质量。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：239.
［2］ 李永吉.中药质量检验常规［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：496. |
|
|Archiver|手机版|小黑屋|魅优论文范文网
( 琼ICP备10200388号-7 )
发表于 2014-8-17 22:43:42
收藏
转播
支持
反对