高效液相色谱法同时测定金银花及叶中的黄酮类物质

amy54321 · 发表于 2014-8-17 22:45:02

【摘要】  目的建立金银花和金银花叶提取物中黄酮类物质槲皮素及木犀草素的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法，以甲醇0.02％磷酸(50∶50)为流动相，检测波长350 nm。结果槲皮素、木犀草素分别在4.0～ 20，3.8～ 19μg/ml的浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系,它们的加标回收率在95.07% ～ 97.98%范围内, 相对标准偏差0.32%～ 3.34%。结论此方法简便、灵敏、快速，可用于金银花药材中黄酮类物质的含量测定。

【关键词】  金银花；金银花叶；槲皮素；木犀草素；高效液相色谱
　　Simultaneous Determination of Flavonoid Compounds in Lonicera japonica and its Leaf by High Performance Liquid Chromatography

　　Abstract：ObjectiveTo establish the method for the determination of both quercetin and lonicerin in Lonicera japonica and its leaf simultaneously.MethodsThe components of quercetin and lonicerin in Lonicera japonica and its leaf were determined by the high performance liquid chromatographic at detection wavelength of 350 nm with methanol0.02%phosphoric acid as mobile phase.ResultsThe calibration curves of quercetin and lonicerin between the peak areas and concentrations were linear within their testing ranges of 4.0～ 20 μg/ml and 3.8～ 19μg/ml respecitively, and the recoveries of two compounds were all between 95.07%～97.98%,  RSD was 0.32%～3.34%.ConclusionThe results showed that a simple, sensitive, precise method can be used to determine the flavonoid compounds in Lonicera Japonica.

　　Key words：Lonicera japonica ;  Lonicera japonica leaf ;  Quercetin; Lonicerin; High performance liquid chromatography

　　金银花为名贵中药材之一，具有清热解毒，疏散风热等功效［1］，自古以来，就被民间广泛使用。金银花叶作为金银花药材的一种副产物，产量较大，但长期以来都作为非药用部分而未得到利用。研究表明，金银花和金银花叶中都含有一定量的黄酮［3，4］，这些黄酮类物质具有抗炎、抗高血压、抗癌等药理作用［2］，是金银花及叶中的主要活性成分之一。目前黄酮类化合物的测定方法有紫外分光光度法、铝盐显色分光光度法、梯度洗脱反相高效液相色谱法等［5］，而且主要以分光光度法为主测定总黄酮的含量，应用高效液相色谱法测定的还较少。到目前为止，只对金银花中的黄酮单体含量进行了测定［6］，对于叶的相关研究至今还未见报道。

　　本实验采用反相高效液相色谱法，直接对金银花及叶中的黄酮类物质槲皮素和木犀草素进行分离与测定，方法简便快速，结果可靠，为金银花及叶中黄酮类物质的研究提供了参考。

　　1  仪器和试剂

　　高效液相色谱仪 Agilent 1100（Agilent公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司），超声波发生器（江苏昆山超声仪器有限公司），电光分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

　　甲醇为色谱纯，水为二次蒸馏水，槲皮素和木犀草素对照品购于北京丰斯特公司；其它试剂均为分析纯；金银花和金银花叶采自银川附近。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Zorbax 80A，ExtendC18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm） Agilent公司；流动相为甲醇∶0.02%磷酸(50 ：50)；流速为1.0 ml/min ；检测波长350 nm ；柱温 30℃；进样量10.0 μl。

　　2.2  对照品和供试品溶液的制备  对照品溶液的制备准确称取槲皮素对照品0.030 0 g ，用甲醇溶解并定容于50 ml容量瓶，配制成0.60 mg/ml的溶液。取该溶液1.00 ml , 用甲醇稀释并定容至10  ml, 即得浓度为0.06 mg/ml的槲皮素对照品溶液。记为溶液A。以相同的方法制备浓度为0.057 mg/ml的木犀草素对照品溶液。记为溶液B。取1 ml溶液A和1 ml溶液B，混合均匀，得到溶液C。

　　供试品溶液的制备分别称取5 g经过干燥粉碎的金银花和金银花叶各一份，用100 ml甲醇在40℃超声提取30 min , 过滤，减压浓缩，浓缩液用石油醚除杂，然后用甲醇定容至25 ml容量瓶，即得到金银花和金银花叶的供试品溶液。

　　2.3  色谱分离在2.1项色谱条件下，取溶液C进样，得到槲皮素和木犀草素的色谱图（图 1），同样条件下，得到金银花和金银花叶供试品溶液的色谱图（图2～3）。

　　2.4  线性考察取槲皮素溶液A和木犀草素溶液B, 分别将它们用甲醇稀释，得一系列不同质量浓度的对照品溶液后进样，以对照品溶液的浓度C（单位：μg/ml）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，得槲皮素和木犀草素对照品溶液的回归方程。结果见表1。

　　表1  校准曲线方程（略）

　　1 .槲皮素       2. 木犀草素

　　图1  槲皮素和木犀草素对照品色谱图（略）

　　图2  金银花供试品溶液的HPLC图（略）

　　图3  金银花叶供试品溶液的HPLC图（略）

　　2.5  精密度实验在2.1项色谱条件下，取同一浓度对照品溶液，重复进样5次，测定峰面积，计算槲皮素和木犀草素的RSD分别为1.08% 和0.38%。　2.6  重复性实验取同一批金银花和金银花叶粉末各3份，按上述方法制备供试品溶液并进行含量测定。计算花中槲皮素和木犀草素含量的RSD分别为 2.73%和0.32%；叶中槲皮素和木犀草素含量的RSD分别为3.34%和0.33%。

　　2.7  稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，1，2，3，5，12，24 h进样，测定峰面积，计算花中槲皮素和木犀草素含量的RSD分别为 2.21%和0.65%；叶中槲皮素和木犀草素含量的RSD分别为2.23%和0.48%。

　　2.8  回收率实验分别取已测知含量的金银花和金银花叶供试品溶液1.00 ml各3份，以高中低3浓度水平加入适量的槲皮素和木犀草素对照品溶液，测定其含量，计算加样回收率和RSD。结果见表2～3。

　　表2  金银花供试品溶液的加标回收实验结果（略）

　　表3  金银花叶供试品溶液的加标回收实验结果（略）

　　2.9  样品分析分别取金银花和金银花叶粉末各3份，按2.2项制备成供试品溶液后进样，在2.1项色谱条件下测定，计算含量。结果见表4。

　　表4  样品测定结果（略）

　　3  讨论

　　分别对槲皮素和木犀草素的对照品溶液在200～900 nm进行紫外扫描，二者的最大和次大吸收峰分别在350 nm和255 nm ,由于在350 nm吸收最强，且干扰较少，故选用350 nm作为检测波长。

　　在实验时，用甲醇超声提取金银花和金银花叶中的黄酮类化合物, 然后过滤，减压浓缩，浓缩液用石油醚除杂后定容检测，这样得到的色谱峰形较好，杂质峰较少，比直接将浓缩液定容检测效果要理想。

　　3.3  本研究表明，采用反相高效液相色谱法直接对金银花及叶中的黄酮类物质槲皮素和木犀草素进行分离与测定，此方法简便快速，结果可靠。

【参考文献】
  　　［1］ “全国中草药汇编”编写组.全国中草药汇编(上册),第2版［M］.北京:人民卫生出版社,1996：5531.

　　［2］兰真，曾凡骏，曾里,等.生物类黄酮对心血管系统的调节和作用机理［J］.现代预防医学，2005，32（6）：613.

　　［3］景小琦，武雪芬，雷敬卫.金银花枝叶中粗黄酮、无机元素和蛋白质含量测定［J］.河南中医，2001，21(4)：66.

　　［4］石钺,石任兵，陆蕴如. 我国药用金银花资源、化学成分及药理研究进展［J］.中国药学杂志,1999，34(11):724.

　　［5］肖建波，朱华，钟世安,等. 反相高效液相色谱法用于地钱中黄酮类化合物的分离与测定［J］.分析试验室，2005，24(4):17.

　　［6］黄雄，李松林，李萍,等. HPLC法同时测定金银花中8种黄酮的含量［J］.药学学报，2005，40(3)：285.

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