免疫印迹技术分析树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响

amy54321 · 发表于 2014-8-18 13:43:31

【摘要】  目的探明树舌多糖（GAPS）GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响。方法昆明种小鼠随机分为两组：肿瘤组和树舌多糖组，接种后各组肌肉注射给药，分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10 d，于末次给药24 h，处死小鼠，剥离肿瘤组织。Western blot技术检测各组样品PTEN蛋白的表达量。结果肿瘤组检测结果为阴性，树舌多糖组检测结果为阳性。结论树舌多糖GF抗肿瘤的作用靶点之一可能为抑癌基因PTEN。

【关键词】  树舌多糖GF； H22肝癌移植瘤； PTEN蛋白

　　Study on the Effects of GAPSGF on the Expression of PTEN in Transplantation Tumor of Hepatoma H22 by Western Blot Technology

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of ganoderma applanatum polysaccharides（GAPS）GF on the expression of PTEN protein in transplantation tumor of hepatoma H22. MethodsMice of Kunming strain were divided randomly into two groups: tumor group and GAPS group. All the mice were inoculated with hepatoma H22, then were injected with normal saline and GAPSGF respectively for 10 days. After the last time of injection, all the mice were killed and were peeled off the tumor tissue and observed the expression of PTEN protein by western blot. ResultsThe result of tumor group was negative, whereas the result of GAPSGF group was positive. ConclusionOne of the anti-tumor action target of GAPSGF may be the antioncogene PTEN.

　　Key words：GAPSGF；  Transplantation tumor of hepatoma H22； PTEN proteins

　　树舌Ganoderma lipsiense，又称“老牛肝”“扁芝”或“扁木灵芝”，是一种大型担子菌，其性平，味微苦，临床多用于治疗乙型肝炎、食道癌、神经衰弱和肺结核等病症。树舌多糖GF是从树舌中提取的一个组分，有明显抗肿瘤的作用，能显著抑制H22肝癌移植瘤p53基因［1］，N-Ras基因［2］的表达和提高p16［3］，Rb［4］的表达量。本研究采用western blot技术研究树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响，旨在为树舌多糖GF寻找新的分子靶点，为其作为抗肿瘤药物的临床应用提供更为充分的理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂兔抗小鼠PTEN多克隆抗体，Santa Cruz公司产品；过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品；NC膜，华美公司产品；分子量标准，PMSF，EDTA，RNase，DNase为Sangon公司产品；Tris，丙烯酰胺，N，N＇亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵，SDS，TEMED均为sigma公司产品；琼脂糖等试剂为国产分析纯。

　　1.2  设备XL100K低温离心机， DYZ28A型垂直板电泳槽，DYY11型电泳仪，恒温摇床，75℃冰箱，Mettler电子天平，Millipore超纯水机，UV1700紫外可见分光光度计，转印仪等。

　　1.3 方法

　　1.3.1  造模与给药雌雄各半的昆明种小鼠20只，，随机分为2组，每组10只：分别为肿瘤组和树舌多糖组。选择7～10 d生长良好的瘤株，无菌取腹水，用生理盐水1∶ 3稀释至2.0×106个/ml，0.2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，以0.2 ml/只接种于小鼠右侧腋窝下。接种6 h后，各组肌肉注射给药0.1 ml/只。树舌多糖组按50 mg/kg/d给药，肿瘤组小鼠给与生理盐水，连续10 d。

　　1.3.2  可溶性蛋白的提取于末次给药24 h，处死小鼠，剥离肿瘤组织，置于冰冷的研钵中，加适量液氮研磨。然后置于3倍体积细胞裂解液中，用玻璃匀浆器进行匀浆。在匀浆液中加入20 μg/ml DNaseⅠ和5 μg/ml RNase A，4℃作用15 min，再振荡混匀5 min，然后4℃，25 000 g离心45 min，小心避开表面的脂质层取上清液，即为蛋白提取物。lowry法测定蛋白质浓度，-75℃保存。各组样品等量混合，即为western blot所用样品。

　　1.3.3 western blot法通过方法1.3.2获取的蛋白质样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDSPAGE)，每孔上样量80 μg，10%分离胶浓度，恒定电流10 mA。电泳后进行NC膜转移，在冷却条件下100 V电转4 h。将NC膜浸泡于3% BSA/TBS溶液中，4℃封闭过夜。洗膜后加入兔抗小鼠PTEN多克隆抗体（1∶100稀释），室温孵育2 h。再次洗膜后加入过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，室温孵育0.5 h。洗膜后加入DAB染液，至蛋白条带清晰可见时，把NC膜迅速放入超纯水中终止反应。用吸水纸吸干NC膜上的水分后，用扫描仪进行扫描，保存实验结果。　　2  结果

　　western blot法检测PTEN的结果见图1。图中泳道1为蛋白分子量Marker，泳道2为肿瘤组样品，泳道3为树舌多糖组样品。从图中可以看出，肿瘤组样品western blot的结果为阴性，而树舌多糖组样品的染色结果为阳性（PTEN蛋白的分子量为47KD）。

　　1 Marker  2肿瘤组  3树舌多糖组

　　图1 western blot法检测PTEN（略）

　　3  讨论

　　PTEN是继p53之后又一明星抑癌基因，具有双专一磷酸酶活性，在酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导的信号传导过程中具有重要的作用, 可以通过特异性地抑制三磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K) 依赖的蛋白激酶B (PKB或A KT)的激活［5］，催化二磷酸磷脂酰肌醇(P IP2)与PIP3脱磷酸, 借此调节细胞生命活动的。已在多种肿瘤中发现PTEN的突变或缺失。其抑制肿瘤生长的主要作用表现在：①可能通过诱导细胞G1期阻滞抑制细胞周期进展和诱导细胞的凋亡作用来抑制细胞生长；②PTEN的双特异性磷酸酶(DSP)可通过参与整合蛋白所激发的跨膜信号传导和下调聚集黏附的黏着斑激酶(FAK)磷酸化水平,而抑制细胞的趋化、迁移、铺展、聚集和黏附［6，7］；③主要通过调节蛋白质的合成而调节未分化和已分化细胞的体积［8］，调节未分化细胞的细胞增殖［9］；④PTEN下调血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的水平，可以影响其分泌，从而调控血管生长［10］，进而影响肿瘤的生长和转移。PTEN cDNA的5＇端的非翻译区中有多个CGC重复序列，为甲基化提供了调节可能。高甲基化使PTEN基因处于静止态,造成PTEN的低水平转录或PTEN蛋白的缺失［11］，从而消除了PTEN对一些肿瘤细胞系生长的抑制能力。本研究western blot的结果显示，肿瘤组样品结果为阴性，而树舌多糖组样品的染色结果为阳性。这说明，PTEN蛋白在小鼠H22肝癌移植瘤中表达量大幅度降低，或发生基因的缺失，应用western blot法检测不到它的表达；树舌多糖GF可以诱导H22肝癌移植瘤PTEN的表达或阻止其缺失，故而应用western blot法可以检测到它的表达。而小鼠H22肝癌移植瘤PTEN基因的表达产物明显减少很可能是由于肿瘤细胞PTEN基因5＇端的非翻译区中CGC重复序列的高度甲基化造成的。树舌多糖GF可以显著增强小鼠H22肝癌移植瘤PTEN基因的表达，这提示着树舌多糖GF抗肿瘤的分子机制之一可能是通过抵御肿瘤细胞PTEN基因5＇端非翻译区的甲基化而上调PTEN的表达，从而达到抑制肿瘤生长的目的。

【参考文献】
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　　［3］于英君，潘洪明，张庆梅，等．树舌多糖GF对HepA瘤细胞p16基因表达的影响［J］.中医药学刊，2002，20（2）：160.

　　［4］张庆梅，刘丽波，潘洪明，等．树舌多糖GF对小鼠HepA瘤Rb基因表达的影响［J］.中医药学刊，2002，20（4）：431.

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　　［9］ Backman S，Stambo lic V，M ak T．PTEN function in mammalian cell size regulation［J］.Curr Op in N eurobio l，2002，12（5）：516.

　　［10］ Koul D，Shen R，Garyali A，et al． MMAC?PTEN tumor suppressor gene regulates vascular endothelial growth factor mediated angiogenesis in prostate cancer［J］.Int J Onco l，2002，21（3）：469.

　　［11］ NR Leslie，Alex GRAY，Ian P， et al．Analysis of the cellular functions of PTEN using catatlytic domain and c2terminal deletion on signaling pathway downstream of phosphoinsitide 3kinase［J］.J Biol，2000，346：872.

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