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作者：孙艳，冯立 ，王洪军，年春志，禇征，王立强 ，张志强，吴益民
【摘要】 目的研究人参多糖对大鼠卵巢功能的作用。方法采用体外细胞培养观察人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞分泌孕酮与cAMP的影响，并检测了卵母细胞的存活率。分离培养黄体、颗粒与卵母细胞，设对照组与不同浓度人参多糖实验组，采用放免分析方法测定孕酮与cAMP生成含量，细胞存活率检测采用MTT法。结果与对照组比较，孕酮含量：黄体细胞为（6 573.46±185.14）与(4509.55±126.82)pmol，颗粒细胞为（197.16±42.87）与(320.42±12.46)pmol。cAMP：黄体细胞为（31.20±17.13）与(65.26±15.93)fmol，颗粒细胞为(121.15±19.96)与(296.42±27.28)fmol。结论 人参多糖抑制HCG诱导黄体细胞孕酮分泌，促进HCG诱导颗粒细胞孕酮分泌。而协同黄体细胞与颗粒细胞cAMP生成，人参多糖使卵母细胞生长抑制率降低，呈区间剂量依赖关系。
【关键词】 人参多糖； 孕酮； 环腺苷酸； 人绒毛膜促性腺激素
The Effect of Ginseng Polysugar on Secretion Function of Luteal and Granulose Cell of Rat in vitro
Abstract：ObjectiveTo study using of ginseng polysugar on secretion function of female rat ovary. The experiment had observed progesterone and cAMP by HCG inducing luteal and granulose cell as well as living cell rate of oocyte in vitro.MethodsRat luteal and granulose cell and oocyte was cultivated, cell counting was worked by microscope, progesterone and cAMP content was determined by radioimmunoassay kit(RIA kit). Cell exist rate of oocyte was determined by MTT way. ResultsProgesterone: the luteal cell test groups compare with control group, 6573.46±185.14 and（4509.55±126.82）pmol.The granulose cell test groups compare with control group, 197.16±42.87 and (320.42±12.46)pmol.cAMP: the luteal cell test groups compare with control group, 31.20±17.13and(65.26±15.93)fmol，the granulose cell test groups compare with control group, 121.15±19.96 and (296.42±27.28)fmol.ConclusionThis treatise had demonstrated that ginseng polysugar can inhibit HCG inducing progesterone secretion and enhancing cAMP content of luteal and granulose cell of rat, ginseng polysugar has lower oocytes cell grow up inhibitory rate. It is evident that ginseng polysugar possesses characteristic of dose dependent.
Key words：Ginseng polysugar; Progesterone; cAMP; HCG
许多研究表明人参多糖具有补养元气、增强性腺机能的作用［1］，其通过影响下丘脑垂体性腺轴分泌系统后，靶器官组织则通过细胞内cAMP信息传递系统启动一系列生理生化反应，卵巢作为下丘脑-垂体-性腺轴作用的生殖系统，其受到人参多糖的作用，加速性成熟过程，生殖周期的功能也会发生不同的变化。人参多糖对生殖细胞的影响比较复杂，尚缺乏全面系统的详细报道，为探讨人参多糖对人绒毛膜促性腺激素（HCG）诱导的大鼠黄体与颗粒细胞分泌功能，本研究采用体外细胞培养的方法观察了人参多糖对HCG诱导的大鼠卵巢黄体与颗粒细胞分泌孕酮与cAMP的含量变化，并检测了细胞存活率。本研究内容未见相关报道，现将结果报道如下。
1 材料
1.1 动物与细胞体重为250～300 g左右成年健康雌性大鼠，购自中国医科大学实验动物中心，在本实验室分笼饲养，颗粒饲料，自动饮水，适应1周后进行实验。黄体细胞、颗粒细胞与卵母细胞取自大鼠卵巢。
1.2 试剂与仪器MoCoy's 5a培养基干粉、胶原酶、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、肝素购自Sigma公司；小牛血清购自上海生物工程公司；孕马血清购自天津实验动物中心；人参多糖由吉林大学化学教研室惠赠（2 g/L）；3H-孕酮购自上海生物制品研究所；125I-cAMP放免药盒购自上海中医学院，二甲苯、PPO，POPOP，HCI，NaOH等购自沈阳化学试剂公司，均为分析纯；CO2培养箱：美国Shel-Lab公司，型号1815TC；超净工作台：江苏苏州安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD；倒置相差显微镜：日本Olympus公司，型号CX21FS1。低温离心机：美国Beckman公司，型号J2-21；液闪仪：瑞典LKB公司（机效50%），型号LKB1211；Kontro γ -计数仪：瑞士公司，型号Kontro-28D。
2 方法
2.1 细胞培养
2.1.1 黄体细胞的制备与培养将雌性大鼠颈部皮下注射孕马血清50U/只，48 h后皮下注射人绒毛膜促性腺激素45U/只，1周后，动物断头处死，无菌取卵巢，将黄体化卵巢剪碎，0.2%胶原酶5 ml消化，置37℃培养箱，每15 min吸管吹打，1 h后，加入5 ml MoCoy's 5a培养液，混匀，200 r/min，离心2 min。弃沉淀，1300 r/min，离心10 min，弃上清，加入培养液10 ml，1 300 r/min，离心10 min，洗2次。加新培养液，混匀，取50 μl，再加50 μl 0.4%台盼蓝，细胞计数，计算细胞总数与活细胞百分率。用5%胎牛血清MoCoy's 5a培养液调至30万细胞/0.5 ml，加入人参多糖（30 ng/ml），接种24孔培养板，5%CO2，95%通气，37℃培养24 h，0.5 ml无血清MoCoy's 5a培养液洗1次，加含有人参多糖0.9～1 ml无血清培养液，24 h后，换液，洗1次。加无血清培养液1 ml，设对照组与人参多糖实验组，将含有人参多糖的培养液细胞培养48 h，收集培养液，煮沸5 min，-20℃存放，用于孕酮与cAMP放免测定。
2.1.2 颗粒细胞的制备与培养 将雌性大鼠腹部皮下注射去氢已烯雌酚油剂0.5 mg/0.1 ml/只，连续注射4 d，第5天后，动物断头处死，无菌取卵巢，将用去氢已烯雌酚油剂处理的大鼠卵巢用小号针头（41/2）刺破卵泡，释放出颗粒细胞。离心，收细胞，加适量培养液，取50 μl，加50 μl 0.4%台盼蓝，计数细胞数与活细胞百分率。活细胞一般在40%～60%之间。按活细胞数用5%胎牛血清MoCoy's 5a培养液调至30万细胞/0.5 ml, 加入人参多糖，接种24孔培养板24 h，用无血清培养液洗1次，设37℃对照组与人参多糖实验组，将含有人参多糖的培养液细胞培养24 h，收集培养液，煮沸5 min，-20℃存放，用于孕酮、cAMP的放免测定。
2.1.3 卵母细胞的制备与培养 将雌性大鼠颈部皮下注射孕马血清，25U/只，刺激卵泡发育，48 h后，将动物断头处死，腹部用75%酒精消毒，在超净台内取下卵巢，将用孕马血清处理48 h的卵巢，在解剖镜下尽可能分成含有几个卵泡的小块，用针头刺破卵泡，释放到含有100 μl/ml氨茶碱的培养液中，离心即可收集卵母细胞，将卵母细胞收集在24孔培养板中，加入人参多糖培养8 ～10 h。之后加入含0.2%透明质酸酶、1%柠檬酸钠与10 mmol/L EDTA培养液，设37℃对照组与人参多糖实验组，在相差镜计数卵母细胞的存活率。
2.2 甾体激素与第二信使含量的测定
2.2.1 孕酮的放免测定具体操作过程参照试剂盒说明书，样品制备参考文献［2］。
2.2.2 cAMP的放免测定具体操作过程按试剂盒说明书进行。
2.3 细胞存活率的MTT实验取传代培养黄体与颗粒细胞，胰酶消化后计数，用台盼蓝拒染法测得活细胞数为90%以上，接种于灭菌96孔培养板中，每孔为1×104。实验组加入不同剂量人参多糖，对照组加PBS溶液，每组设5个复孔。各孔用培养液补足至终体积为200 μl。置37℃，5%CO2 孵箱内孵育24 h后，加入噻唑蓝PBS溶液（5 g/L），每孔20 μl，37℃反应4 h后，吸弃培养液及未反应的噻唑蓝，每孔加入 DMSO溶液100 μl，振荡后室温下静止10 min，用酶标仪于570 nm处测定吸收光（A值），计算细胞生长抑制率。 作者：孙艳，冯立 ，王洪军，年春志，禇征，王立强 ，张志强，吴益民
【摘要】 目的研究人参多糖对大鼠卵巢功能的作用。方法采用体外细胞培养观察人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞分泌孕酮与cAMP的影响，并检测了卵母细胞的存活率。分离培养黄体、颗粒与卵母细胞，设对照组与不同浓度人参多糖实验组，采用放免分析方法测定孕酮与cAMP生成含量，细胞存活率检测采用MTT法。结果与对照组比较，孕酮含量：黄体细胞为（6 573.46±185.14）与(4509.55±126.82)pmol，颗粒细胞为（197.16±42.87）与(320.42±12.46)pmol。cAMP：黄体细胞为（31.20±17.13）与(65.26±15.93)fmol，颗粒细胞为(121.15±19.96)与(296.42±27.28)fmol。结论 人参多糖抑制HCG诱导黄体细胞孕酮分泌，促进HCG诱导颗粒细胞孕酮分泌。而协同黄体细胞与颗粒细胞cAMP生成，人参多糖使卵母细胞生长抑制率降低，呈区间剂量依赖关系。
【关键词】 人参多糖； 孕酮； 环腺苷酸； 人绒毛膜促性腺激素
The Effect of Ginseng Polysugar on Secretion Function of Luteal and Granulose Cell of Rat in vitro
Abstract：ObjectiveTo study using of ginseng polysugar on secretion function of female rat ovary. The experiment had observed progesterone and cAMP by HCG inducing luteal and granulose cell as well as living cell rate of oocyte in vitro.MethodsRat luteal and granulose cell and oocyte was cultivated, cell counting was worked by microscope, progesterone and cAMP content was determined by radioimmunoassay kit(RIA kit). Cell exist rate of oocyte was determined by MTT way. ResultsProgesterone: the luteal cell test groups compare with control group, 6573.46±185.14 and（4509.55±126.82）pmol.The granulose cell test groups compare with control group, 197.16±42.87 and (320.42±12.46)pmol.cAMP: the luteal cell test groups compare with control group, 31.20±17.13and(65.26±15.93)fmol，the granulose cell test groups compare with control group, 121.15±19.96 and (296.42±27.28)fmol.ConclusionThis treatise had demonstrated that ginseng polysugar can inhibit HCG inducing progesterone secretion and enhancing cAMP content of luteal and granulose cell of rat, ginseng polysugar has lower oocytes cell grow up inhibitory rate. It is evident that ginseng polysugar possesses characteristic of dose dependent.
Key words：Ginseng polysugar; Progesterone; cAMP; HCG
许多研究表明人参多糖具有补养元气、增强性腺机能的作用［1］，其通过影响下丘脑垂体性腺轴分泌系统后，靶器官组织则通过细胞内cAMP信息传递系统启动一系列生理生化反应，卵巢作为下丘脑-垂体-性腺轴作用的生殖系统，其受到人参多糖的作用，加速性成熟过程，生殖周期的功能也会发生不同的变化。人参多糖对生殖细胞的影响比较复杂，尚缺乏全面系统的详细报道，为探讨人参多糖对人绒毛膜促性腺激素（HCG）诱导的大鼠黄体与颗粒细胞分泌功能，本研究采用体外细胞培养的方法观察了人参多糖对HCG诱导的大鼠卵巢黄体与颗粒细胞分泌孕酮与cAMP的含量变化，并检测了细胞存活率。本研究内容未见相关报道，现将结果报道如下。
1 材料
1.1 动物与细胞体重为250～300 g左右成年健康雌性大鼠，购自中国医科大学实验动物中心，在本实验室分笼饲养，颗粒饲料，自动饮水，适应1周后进行实验。黄体细胞、颗粒细胞与卵母细胞取自大鼠卵巢。
1.2 试剂与仪器MoCoy's 5a培养基干粉、胶原酶、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、肝素购自Sigma公司；小牛血清购自上海生物工程公司；孕马血清购自天津实验动物中心；人参多糖由吉林大学化学教研室惠赠（2 g/L）；3H-孕酮购自上海生物制品研究所；125I-cAMP放免药盒购自上海中医学院，二甲苯、PPO，POPOP，HCI，NaOH等购自沈阳化学试剂公司，均为分析纯；CO2培养箱：美国Shel-Lab公司，型号1815TC；超净工作台：江苏苏州安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD；倒置相差显微镜：日本Olympus公司，型号CX21FS1。低温离心机：美国Beckman公司，型号J2-21；液闪仪：瑞典LKB公司（机效50%），型号LKB1211；Kontro γ -计数仪：瑞士公司，型号Kontro-28D。
2 方法
2.1 细胞培养
2.1.1 黄体细胞的制备与培养将雌性大鼠颈部皮下注射孕马血清50U/只，48 h后皮下注射人绒毛膜促性腺激素45U/只，1周后，动物断头处死，无菌取卵巢，将黄体化卵巢剪碎，0.2%胶原酶5 ml消化，置37℃培养箱，每15 min吸管吹打，1 h后，加入5 ml MoCoy's 5a培养液，混匀，200 r/min，离心2 min。弃沉淀，1300 r/min，离心10 min，弃上清，加入培养液10 ml，1 300 r/min，离心10 min，洗2次。加新培养液，混匀，取50 μl，再加50 μl 0.4%台盼蓝，细胞计数，计算细胞总数与活细胞百分率。用5%胎牛血清MoCoy's 5a培养液调至30万细胞/0.5 ml，加入人参多糖（30 ng/ml），接种24孔培养板，5%CO2，95%通气，37℃培养24 h，0.5 ml无血清MoCoy's 5a培养液洗1次，加含有人参多糖0.9～1 ml无血清培养液，24 h后，换液，洗1次。加无血清培养液1 ml，设对照组与人参多糖实验组，将含有人参多糖的培养液细胞培养48 h，收集培养液，煮沸5 min，-20℃存放，用于孕酮与cAMP放免测定。
2.1.2 颗粒细胞的制备与培养 将雌性大鼠腹部皮下注射去氢已烯雌酚油剂0.5 mg/0.1 ml/只，连续注射4 d，第5天后，动物断头处死，无菌取卵巢，将用去氢已烯雌酚油剂处理的大鼠卵巢用小号针头（41/2）刺破卵泡，释放出颗粒细胞。离心，收细胞，加适量培养液，取50 μl，加50 μl 0.4%台盼蓝，计数细胞数与活细胞百分率。活细胞一般在40%～60%之间。按活细胞数用5%胎牛血清MoCoy's 5a培养液调至30万细胞/0.5 ml, 加入人参多糖，接种24孔培养板24 h，用无血清培养液洗1次，设37℃对照组与人参多糖实验组，将含有人参多糖的培养液细胞培养24 h，收集培养液，煮沸5 min，-20℃存放，用于孕酮、cAMP的放免测定。
2.1.3 卵母细胞的制备与培养 将雌性大鼠颈部皮下注射孕马血清，25U/只，刺激卵泡发育，48 h后，将动物断头处死，腹部用75%酒精消毒，在超净台内取下卵巢，将用孕马血清处理48 h的卵巢，在解剖镜下尽可能分成含有几个卵泡的小块，用针头刺破卵泡，释放到含有100 μl/ml氨茶碱的培养液中，离心即可收集卵母细胞，将卵母细胞收集在24孔培养板中，加入人参多糖培养8 ～10 h。之后加入含0.2%透明质酸酶、1%柠檬酸钠与10 mmol/L EDTA培养液，设37℃对照组与人参多糖实验组，在相差镜计数卵母细胞的存活率。
2.2 甾体激素与第二信使含量的测定
2.2.1 孕酮的放免测定具体操作过程参照试剂盒说明书，样品制备参考文献［2］。
2.2.2 cAMP的放免测定具体操作过程按试剂盒说明书进行。
2.3 细胞存活率的MTT实验取传代培养黄体与颗粒细胞，胰酶消化后计数，用台盼蓝拒染法测得活细胞数为90%以上，接种于灭菌96孔培养板中，每孔为1×104。实验组加入不同剂量人参多糖，对照组加PBS溶液，每组设5个复孔。各孔用培养液补足至终体积为200 μl。置37℃，5%CO2 孵箱内孵育24 h后，加入噻唑蓝PBS溶液（5 g/L），每孔20 μl，37℃反应4 h后，吸弃培养液及未反应的噻唑蓝，每孔加入 DMSO溶液100 μl，振荡后室温下静止10 min，用酶标仪于570 nm处测定吸收光（A值），计算细胞生长抑制率。 2.4 统计学方法实验的计量资料均以均值±标准差表示，组间差异用t检验。
3 结果
3.1 人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞基础孕酮生成的影响用人参多糖30 ng/ml作用于生长状态良好的黄体细胞48 h，与颗粒细胞24 h，换含HCG 0.15 Ｕ/ml新培养液，继续在37℃的CO2培养箱中培养。黄体细胞培养8h，颗粒细胞培养6 h后，收集培养液，测定孕酮生成的含量。结果表明，人参多糖抑制HCG刺激黄体细胞孕酮生成与加强颗粒细胞孕酮生成，具体表现在人参多糖使黄体细胞基础孕酮生成含量降低与颗粒细胞增加，人参实验组与对照组比较P＜0.05。见表1。
表1 人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞孕酮含量（略）
与对照组比较，* P＜0.05
3.2 人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞基础cAMP生成的影响人参多糖实验组按30 ng/ml分别预处理黄体与颗粒细胞48 h与24 h，换新培养液，加入0.15 Ｕ/ml HCG，继续在37℃的CO2培养箱中培养4 h。测定cAMP含量（见表2）。人参多糖对黄体与颗粒细胞基础cAMP生成含量的调节，表现在人参多糖使黄体与颗粒细胞基础cAMP生成含量增加，人参实验组与对照组比较P＜0.05。表明人参多糖与HCG具有协同作用。
3.3 人参多糖对低温应激卵母细胞存活率的影响 不同剂量人参多糖培养液作用于卵母细胞后，与对照组比较，加人参多糖组从20 μl起，即对细胞具有明显的促增殖作用,而且随着人参多糖浓度的增加对细胞的分裂促增殖作用也增强，呈剂量依赖性正向关系, 表明人参多糖对细胞增长曲线的调节呈量-效关系，但在35～60 μl之间出现平台期，说明再增加人参多糖剂量已经不能无限度地促进细胞分裂。细胞生长抑制率为（1-实验组A值均值/对照组A值均值）×100%（见图1）。说明人参多糖可促使细胞生长，死亡率降低。
表2 人参多糖对HCG诱导的黄体与颗粒细胞基础cAMP含量（略）
与对照组比较，* P＜0.05
图1 不同浓度人参多糖对卵母细胞抑制率的影响（略）
4 讨论
人参多糖对卵巢黄体与颗粒细胞的作用比较复杂，对不同种属的细胞类型，细胞的不同发育阶段，或影响因素的存在，观察指标的不同而作用结果不同。本实验观察到的人参多糖对HCG刺激黄体与颗粒细胞孕酮与cAMP生成的相互关系表明，HCG可使黄体与颗粒细胞孕酮和cAMP生成增加，人参多糖抑制HCG刺激的黄体细胞孕酮生成和增进颗粒细胞孕酮分泌，而协同黄体与颗粒细胞cAMP增加。关于人参多糖作用的原理可能是在与机体反应的过程中，特别是对神经-垂体-肾上腺皮质系统的反馈影响有关［3］。人参具有明显的强壮作用，也可能是由于反馈作用抑制了FSH与LH的分泌［4］。因此人参多糖对HCG刺激的黄体与颗粒细胞孕酮生成表现出不同的生物学效应。而本实验中人参多糖协同cAMP生成增加的机制很复杂，根据查阅的文献与本实验结果还难以作出准确的结论，但有一点是明确的，甾体激素是受第二信使cAMP调节的，细胞内信息传递系统间既相互抑制，又有相互增强作用［5］，值得我们深入探讨人参多糖在细胞内信号间传导过程中的机制。人参多糖降低细胞生长抑制率表现出的“丝裂原”样作用，对机体生殖细胞的保健与修复作用具有一定的生理意义。
【参考文献】
［1］ 江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：29.
［2］ Dorfman M, Arancibia S, Fiedler JL, et al. Chronic intermittent cold stress activates ovarian sympathetic nerves and modifies ovarian follicular development in the rat［J］.Biol Reprod, 2003,68(6):2038.
［3］ Sternberg WF, Chesler EJ, Wilson SG, et al. Acute progesterone can recruit sex-specific neurochemical mechanisms mediating swim stress-induced and kappa-opioid analgesia in mice［J］. Horm Behav,2004,46(4):467.
［4］ Luza SM, Arancibia S, Venegas M, et al. Thyrotropin-releasing hormone as a mediator of the central autonomic pathway controlling ovarian function［J］.Neuroendocrinology, 2003,77(4):273.
［5］ Arancibia S, Estupina C, Pesco J, et al. Responsiveness to depolarization of hypothalamic neurons secreting somatostatin under stress and estrous cycle conditions: involvement of GABAergic and steroidal interactions［J］. J Neurosci Res, 1997,50(4):575. |
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发表于 2014-8-18 13:46:25
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