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【摘要】 目的考察超临界CO2 流体萃取伸筋草有效成分的最佳工艺，进一步验证萃取物的药效。方法采用正交实验设计，以萃取物得率为指标，考察萃取压力、萃取温度、解析压力及解析温度4个因素的影响；采用热板法、醋酸扭体法、鼠耳二甲苯致炎法、棉球肉芽肿致炎法观察萃取物的镇痛抗炎效果。结果最佳萃取工艺条件为萃取压力20 mPa，萃取温度35℃，解析压力8 mPa，解析温度55℃，萃取时间4 h；萃取物对热致痛和冰乙酸所致的小鼠扭体疼痛具有良好的镇痛作用，对二甲苯致小鼠耳炎有显著的消炎作用。结论 超临界CO2 流体萃取技术用于伸筋草有效成分提取，方法简单，适用于工业生产。伸筋草超临界萃取物具有显著镇痛抗炎的药理作用。
【关键词】 伸筋草； 超临界二氧化碳萃取； 抗炎； 镇痛
Optimization on Craft and Drug Action Validation of SFECO2 Extract for Lycopodium japonicum Thunb.
Abstract:ObjectiveTo study the optimal technology of supercriticalCO2 fluid extraction(SFECO2) on Lycopodium japonicum Thunb.and validate the drug action of extract.MethodsThe yield of extractant was used as index to evaluate the technologies based on orthogonal design , in which 4 factors considered were extraction temperature and pressure , separation temperature and pressure;the anti- inflammation and analgesia pharmacological actions was observed by drug action experiment.ResultsThe optimum extraction conditions were : extraction pressure 20MPa, temperature 35℃;separation pressure 8MPa, temperature 55℃ ; extraction time 4 hours.The extract had good analgesia pharmacological action to pain caused by heat in mice and by acetic acid causing body distortion test in mice. It also had significant depressions to the inflammation caused by dimethyl benzene on the ear of mice.ConclusionSupercritical fluids extraction method is simple for the activities of Lycopodium japonicum Thunb., and useful for the large scale production. The extract has significant antiinflammation and analgesia pharmacological actions.
Key words: Lycopodium jhponicum Thunb.; SFECO2; Antiinflammatory； Analgesia
中药伸筋草为石松科植物石松Lycopodium juponicum Thunb.的干燥全草。具有祛风除湿、舒筋活络的功效，用于关节酸痛、屈伸不利等症［1,2］。药理研究表明，伸筋草氯仿提取部位具有显著的镇痛消炎作用，而正丁醇提取部位和水提取部位则无此作用或作用较弱［3］。可见，其有效成分多为低极性或脂溶性成分。目前，对本品挥发油等低极性部位的成分研究尚未见报道。超临界二氧化碳流体的极性相当于正己烷，适于萃取中药中的低极性成分，且无溶剂残留，工艺简单，萃取时间短。目前对伸筋草超临界萃取研究未见报道，本实验以萃取率为指标，采用正交实验设计，研究伸筋草超临界CO2 萃取的最佳工艺，并验证萃取物的镇痛抗炎效果，为伸筋草的进一步开发利用提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器与药材HA2315006型超临界萃取装置（江苏南通华安超临界实业公司）；伸筋草购自广州市清平药材市场，经本院生药教研室鉴定为伸筋草Lycopodium japonicum Thunb. 的干燥全草，粉碎成10～20目备用。
1.2 动物NIH种小鼠，体重18～22 g；SD系大鼠，体重为150～180 g，均购自广东省卫生厅医用动物中心。地塞米松片：浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号040763。吗啡注射液：沈阳第一制药厂出品，批号931202。
2 方法与结果
2.1 SFECO2法提取工艺的基本流程将200 g伸筋草粉末投入萃取釜中，对萃取釜、解析釜Ⅰ、贮罐分别进行加热，当达到所选定的温度时，开启CO2气瓶对系统进行加压，当达到所选定的压力时，开始循环萃取，并保持恒温恒压。待达到选定的萃取时间后，从解析釜Ⅰ出料口出料，得淡黄色的油状伸筋草萃取物，计算萃取率(萃取率为每100 g药得到的提取物的量)。
2.2 正交实验选择萃取条件选择萃取压力（A）、萃取温度（B）、解析压力（C）、解析温度（D）4个主要因素，各设定3个水平，设计4因素3水平正交实验L9(34)，对伸筋草进行超临界CO2萃取。因素水平见表1。结果见表2。
表1 提取工艺4因素3水平正交实验方案及结果（略）
2.3 正交实验的验证从表2实验结果综合后分析认为本实验的最佳条件为A3B2C2D3。取伸筋草药材15 kg（n＝3）按最佳工艺进行中试放大实验，各批次的出油率分别为1.13%，1.21%及1.15%。
表2 正交实验结果（萃取率）分析（略）
2.4 萃取物镇痛作用实验
2.4.1 小鼠冰乙酸致痛扭体实验小鼠雌雄各半，体重18～22 g，随机分组，分别灌胃给药（吗啡组腹腔注射），1 h后（吗啡30 min后），每只小鼠腹腔注射0.6%冰乙酸0.2 ml，记录注射后20 min内小鼠因疼痛扭体的次数。结果见表3。
表3 伸筋草萃取物对冰乙酸致小鼠疼痛扭体的影响（略）
与蒸馏水组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01
结果表明，伸筋草萃取物大、中、小剂量组小鼠扭体次数都少于空白组，差异有显著性意义，提示伸筋草萃取物对冰乙酸所致的小鼠扭体疼痛有镇痛作用。 2.4.2 小鼠热板镇痛实验雌性小鼠，体重18～22 g。实验时将水浴箱调节恒温（55±1）℃，放一个大烧杯于水中，将小鼠投入烧杯，记录小鼠从投入烧杯至受热疼痛舔后足的时间，作为该鼠的痛阈值。筛选痛阈值在10～30 s的小鼠，按痛阈值分层随机分组，分别灌药，记录各组给药后30，60，90和120 min时的痛阈值。结果见表4。
表4结果表明，伸筋草萃取物大剂量组在30 ，60 min时,小剂量组在60 min时,小鼠舔后足次数少于空白组，差异有显著性意义，提示伸筋草萃取物对热板致痛小鼠有镇痛作用。
2.5 萃取物抗炎作用实验
2.5.1 对二甲苯所致小鼠急性炎症的影响小鼠雌雄各半，体重18～22 g，随机分组，灌胃给药3 d（地塞米松组灌蒸馏水，于第3天灌胃地塞米松）。末次给药1 h后，将50 ml的二甲苯均匀涂于小鼠右耳两面致炎，左耳做对照，20 min后处死小鼠，用直径6 mm的打孔器将双耳同部位等面积切下，用电子天平分别称重，以左右耳片重量之差为肿胀程度。结果见表5。
表4 伸筋草萃取物对小鼠热板实验镇痛作用的影响（略）
与蒸馏水组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01
表5 伸筋草萃取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（略）
与蒸馏水组比较，**P﹤0.01
表5结果表明，伸筋草萃取物大剂量组肿胀程度小于空白组，差异有显著性意义，提示伸筋草萃取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀有抗急性炎症作用。
2.5.2 对棉球肉芽肿致大鼠慢性炎症的影响大鼠随机分组，每鼠剪去胸部毛约2 cm2，于脱毛处碘酒消毒，酒精脱碘，剪一小口，往两侧腋窝各塞入一个30 mg的消毒棉球（棉球经高压灭菌，庆大霉素液浸泡，60℃烘干），缝合。术后常规饲养，次日开始灌胃给药，灌胃1次/d，连续7 d，末次给药24 h后处死大鼠，取出棉球肉芽组织，烘干，电子天平称重，每鼠两棉球之和除以2为该鼠棉球肉芽肿重量。结果见表6。
表6 伸筋草萃取物对大鼠棉球肉芽肿的影响（略）
与蒸馏水组比较， ***P<0.001
表6可见伸筋草萃取物组棉球重量与蒸馏水组比较无明显差异，表明伸筋草萃取物对棉球所致的慢性炎症无明显影响。
3 讨论
3.1 超临界萃取时CO2流量增大有利于被萃取物从物料中向超临界流体中扩散，使萃取率增加，随着CO2流量达到30 L/h以上，萃取率明显降低，可能是由于流速过快，使流体与物料接触不充分，被萃取物未来得及在解析釜中析出就被冲回萃取釜中而使萃取率下降，因此本实验选用的CO2流量为20 L/h。
3.2 超临界萃取法没有溶剂残留，工艺简单、萃取时间短。本实验最佳工艺条件提取的伸筋草油为淡黄色的油状物，有效成分被高度浓缩，有利于本品的进一步开发利用。3批中试产品结果与实验结果基本一致，表明该萃取条件稳定性好，重复性高，可以应用于工业生产。
3.3 伸筋草成人临床用量为生药量0.45 g/kg体重。药理实验时用50%聚乙二醇400配制成所需浓度,按20.3，6.8，2.3 g生药量/kg剂量给药，相当于临床用量的45，15，5倍。
3.4 药理实验表明，伸筋草超临界提取物具有显著的抗炎镇痛作用，且毒性低，从而验证了伸筋草超临界流体萃取工艺的合理性，同时也为伸筋草的制剂工艺及活性成分的研究奠定了良好的基础。
【参考文献】
［1］ 郑虎占,董泽宏,佘 靖. 中药现代研究与应用，第2卷［M］.北京:学苑出版社,1997：72.
［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录64.
［3］ 曾元儿，叶林荣，徐 晖，等.伸筋草不同提取部位抗炎镇痛药理实验研究［J］.时珍国医国药，1999，10（9）：64. |
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发表于 2014-8-18 13:47:31
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