荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量

amy54321 · 发表于 2014-8-18 17:38:39

  作者：王佩琪，承伟，郭兴杰，范会瑜

【摘要】  目的采用荧光分光光度法，建立了大黄中游离蒽醌类成分含量测定的方法。方法以丙酮为溶剂，在λex =460 nm 和λem =540 nm处测定荧光强度。结果测得游离蒽醌含量在0.25～3.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为F=122.81C +46.224(r=0.999 6),最低检测限为0.25 μg/ml，表明该法灵敏度高、重现性较好，且操作简便。结论该研究为测量大黄中活性成分游离蒽醌提供了一种有效可靠的分析方法。

【关键词】  大黄；游离蒽醌；荧光分光光度法

　　Fluorescence Spectrophotometry for Free Anthraquinones in Rheum emodi

　　Abstract：ObjectiveWith the fluorescence spectrophotometry，to build up free anthraquinones in Rheum emodi method of Assay.MethodsTake acetone as solvent agent, with the λex=460 nm and λem= 540 nm determination fluorescence strength. ResultsFree anthraquinone contents were in 0.25～3.0 of μg/ml with good linear relationship. The linear equation F=122.81C+46.224(r=0.999 6), the lowest detectability was 0.25 μg/ml. The method was sensitive and reproducible.ConclusionThis research for measuring live composition of free anthraquinone in Rheum emodi Wall provides a kind of effectively dependable analytical method.

　　Key words：Rheum emodi；  Free anthraquinone ；  Fluorescence spectrophotometry

　　有效成分含量是评价药材质量的重要指标，现报道的大黄中游离蒽醌检测方法主要有比色法、薄层色谱（TLC）法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管胶束电泳色谱法（MECC）及毛细管电泳色谱法（CEC）。色谱方法通常需要较长的分离分析时间，与之相比光谱法具有显而易见的快速特点；同时荧光分光光度法可用于药物的微量或恒量物质分析，并具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点，因此在药物定量尤其是中药有效成分检测上的应用日趋广泛。已有利用荧光分光光度法测定中药决明子中总蒽醌含量测定的报道［1］。本实验利用羟基蒽醌的荧光特性，在丙酮溶液中，建立了中药大黄中游离蒽醌荧光测定的新方法。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器电子天平（上海精密科学仪器有限公司FA1004型），KQ-500B型超声器（昆山市超声仪器有限公司），LD4-2型低速离心机（北京医疗离心机厂），RE-52A型旋转蒸发器（上海正荣生化仪器厂），970CRT荧光分光光度计（上海精密仪器有限公司）。

　　1.2  材料1，8二羟基蒽醌对照品（中国药品生物制品检定所），95%乙醇（沈阳市东陵区红日化工厂）、丙酮（盛森试剂有限公司）均为分析纯，大黄药材（购自锦州市药材公司），水为亚沸高纯去离子水。

　　2  方法与结果

　　2.1  测定波长的选择用2 ml 3.1 μg/ml的1，8二羟基蒽醌标准液在300～600 nm波长范围内进行激发波长扫描，蒽醌的最大激发波长(λex)为460 nm，固定该激发波长，扫描得发射谱图，得到其发射波长(λem)为540 nm。结果见图1。

　　图1  蒽醌标准液的激发波长和荧光波长（略）

　　选择该最大激发波长和最大发射波长(即λex/λem=460 nm/540 nm)作为后继测定的工作条件。

　　2.2  标准曲线的制备精密称取105℃干燥至恒重的1.8二羟基蒽醌2.5 mg置50 ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀得对照原液。精密量取对照原液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml分别置10 ml棕色容量瓶中，用丙酮定容，以丙酮试剂为空白，在λex =460 nm 和λem=540 nm处测其溶液的荧光强度，结果表明溶液的荧光强度(IF)与溶液浓度(C)在0.25～3.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。见图2。

　　图2  游离蒽醌荧光强度标准曲线图（略）

　　2.3  条件考察

　　2.3.1  溶剂的影响选择丙酮、甲醇、氯仿试剂，考察了对反应体系的影响，结果表明样品在丙酮中荧光强度大、灵敏度高，且空白溶剂在此范围内几乎无荧光吸收(与文献报道一致［2］)，在激发波长为460 nm、发射波长为540 nm处，其拉曼光较小，对实验影响较小，图像也较直观，故本实验选用丙酮作溶剂，见图3。

　　图3  丙酮、甲醇、氯仿荧光效果图（略）

　　2.3.2  放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响依照分析步骤,测定放置不同时间后的1，8-二羟基蒽醌的相对荧光强度。结果见表1。从表1中可以看出,随着放置时间的延长，相对荧光强度逐渐减小，荧光强度在0～3 h内基本稳定，因此应保证在3 h内测定荧光。表1  放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响（略）

　　2.4  样品的测定

　　2.4.1  样品溶液的制备取摄氏60℃干燥1 h的大黄粗粉80 mg，加50 ml 95%乙醇，先在25 kHz频率下超声20 min，然后水浴上加热至微沸，回流1.5 h，采用3 000 r/min的转速离心30 min，取上清液，残渣再加50 ml 95%乙醇液加热回流30 min，离心取上清液，合并两次上清液，浓缩后挥去乙醇，残渣加二次蒸馏水10 ml，1 mol/L NaOH 2滴、氯仿15 ml，分离后将水溶液于冰水浴中并加乙醚10 ml、盐酸0.4 ml后立即密封振摇3 min，静止分层，如此方法萃取3次合并乙醚液，挥尽乙醚后加50 ml丙酮，得样品溶液。

　　2.4.2  精密度实验分别精密吸取样品溶液1 ml于5个10 ml棕色容量瓶中，加丙酮定容。在λex/λem=460 nm/540 nm下测荧光强度。结果见表2。RSD为0.3%，表明该方法的精密度良好。

　　表2  精密度实验结果（略）

　　2.4.3  重现性实验精密称取大黄粗粉80 mg 5份，按样品溶液的制备项下的方法制备样品液，在λex/λem=460 nm/540 nm下测荧光强度。结果见表3。RSD为1.5%，表明该方法的重现性良好。

　　表3  重现性实验结果（略）

　　3  讨论

　　蒽醌母核是一个具有长共轭体系的化合物, 且游离蒽醌的结构上都有多个取代基－OH，更增加了分子的π电子共轭程度，故荧光强度较强；由于游离蒽醌在丙酮中的荧光强度较大、稳定性好，无干扰，故实验文选定丙酮为测定溶剂。

　　研究结果表明利用荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量，具有取样量小、操作简便、快速灵敏的特点 ,可用于人体血清、尿样中的大黄中游离蒽醌的定量分析。

【参考文献】
  　　［1］齐登福.荧光光度法测定中药芦荟大黄素［J］.山东工程学院学报，2002,16(2):5.

　　［2］杨黎燕,郎惠云.荧光分光光度法测定中药中总蒽醌含量［J］.分析科学学报,2004,20(5):551.

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[药学] 荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量