栀子及其近缘类群的随机扩增多态DNA分析

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【摘要】  目的探索栀子与其变种雀舌栀子、重瓣栀子及变型水栀子之间的亲缘关系。方法从56个随机引物中筛选出12个引物对栀子及其近缘类群进行RAPD分析，应用SPSS10.0分析软件中的Jaccard方法计算任意两样品间的相似系数，用组内聚类方法计算得出聚类树状图。结果共得到251个有效位点。聚类分析显示，栀子与重瓣栀子最先聚类，然后与水栀子聚类，最后与雀舌栀子聚类。结论重瓣栀子与栀子亲缘关系最近，雀舌栀子与栀子的亲缘关系最远。

【关键词】  栀子； 近缘类群； 随机扩增多态DNA

　　RAPD Analysis for Gardenia jasminoides and Relatives

　　Abstract：ObjectiveTo probe relative relationship among Gardenia jasminoides，its varietas（G. jasminoides Ellis. var. radicans and G. jasminoides Ellis. var. fortuniana）and its forma（G. jasminoides Ellis. f. longicarpa）.MethodsRAPD analysis for samples of Gardenia jasminoides and relatives were performed by 12 random primers screened from 56 .Proximity matrix was analyzed by SPSS version 10.0 and rescaled distance cluster combine  was obtained by cluster analysis within groups. ResultsA total of 251 polymorphic loci were amplified.It showed that Gardenia jasminoides were clustered with G. jasminoides  Ellis.var. fortuniana at first,then with G. jasminoides Ellis. f. longicarpa, and with G. jasminoides Ellis. var. radicans at last.ConclusionAmong samples, Gardenia jasminoides was the closest relative to G. jasminoides  Ellis.var. fortuniana ,and most distant relative to G. jasminoides Ellis. var. radicans.

　　Key words：Gardenia jasminoides；  Relatives；  RAPD
   
　　栀子为常用中药，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效。分布在长江流域及以南地区，为酸性土壤指示植物。栀子有3变种和1变型［1～7］，即栀子Gardenia jasminoides Ellis.、雀舌栀子G. jasminoides Ellis. var. radicans（Thunb.）Makino、重瓣栀子G. jasminoides Ellis. var. fortuniana （Lindl.）Hara.、大花栀子G. jasminodes var. grandiflora Nakai.、水栀子G. jasminoides Ellis. f. longicarpa Z.W.Xie et Okada.，它们在形态结构上均具有一定的差异，为了探索它们之间的亲缘关系，笔者采用随机扩增多态DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）的技术对其进行了分析。

　　1  器材

　　1.1  仪器PTC－100TM Programmable Thermal Controller （MJ RESEARCH INC，美国），高速离心机IEC Micro－MB centrifuge（IEC公司，美国），DZKW-C型水浴锅（河北省黄骅航天仪器厂），DYY－Ⅲ－5型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶紫外成像系统（SYNGENE ADIVISION of SYNOPRICS LTD，美国），核酸紫外定量仪GENEQUANTII（Pharmacia Biotech，英国）。

　　1.2  试剂Taq酶（华美生物工程公司，200 u，3 μl/μl），琼脂糖（西班牙，华美公司分装），dNTP（华美公司），CTAB（Sigma公司），溴化乙锭（Fluka公司），Tris碱（Ultra Pure，华美公司），EDTA（华美公司），巯基乙醇（上海生工公司），随机引物（上海生工公司），其余试剂为北京化工厂产的分析纯。

　　1.3  材料栀子、雀舌栀子、重瓣栀子、水栀子的叶片均由笔者采集鉴定，用硅胶快速干燥保存，样品采取混合取样，编号见表1。

　　2  方法

　　2.1  DNA提取和浓度测定将干叶片约0.2 mg置于1.5 ml EP管中，加入液氮约30 s后用镊子碾碎成细粉，立即加入500 μl 2×CTAB提取缓冲液［CTAB2％，Tris-HCl(pH 8.0)100 mmol·L-1，EDTA 20 mmol·L-1,NaCl 1.4 mol·L-1,巯基乙醇2％］和20 μl巯基乙醇，60℃水浴保温1h后，加入氯仿－异戊醇（24∶1）抽提，轻颠倒混匀，10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，加入等体积CTAB沉淀缓冲液［CTAB 1％，Tris-HCl(pH 8.0)50 mmol·L-1，EDTA 10 mmol·L-1,巯基乙醇1％］,室温下放置0.5 h以上，10 000 r·min-1离心10 min，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗1次，弃洗液，留沉淀挥干。用20 μl TE溶解备用。
   
　　用0.8％琼脂糖凝胶电泳，以λDNA作对照和用核酸紫外定量仪测定浓度相结合。

　　表1  实验材料来源、采集时间（略）

　　2.2  DNA模板浓度的选择用S267引物对DNA模板的不同浓度扩增结果比较，选择扩增效果好的浓度进行扩增。

　　2.3  PCR扩增25 μl反应体系：dNTPs10 mmol·L-11.5 μl，引物10 μmol·L-10.5 μl，DNA模板约42 ng，Taq酶3 μl/μl 0.5μl，MgCl2 25 mmol·L-11.5 μl，10×Reaction Buffer 2.5 μl。扩增程序为：预变性96℃，5 min；扩增循环40个，为94℃45 s，34℃1 min，72℃1.5 min；后延伸72℃5 min。取8 μl扩增产物于1.8％琼脂糖凝胶上用1×TAE电泳缓冲液电泳，凝胶紫外成像系统检测拍照。　　2.4  引物筛选以1和2号两个模板，用随机引物在上述条件下扩增，选择条带清晰、重复性好的引物作为扩增引物用于RAPD扩增。

　　2.5  数据分析电泳图谱中的每一条带（DNA片段）均为一个分子标记，并代表一个引物结合点，根据分子标记的有无及其迁移率统计得到有位点的二元数据，有带计为1（强带与弱带同计），无带计为0。应用SPSS10.0分析软件中的Jaccard方法计算任意两样品间的相似系数，用Within group聚类方法计算得出聚类树状图。

　　3  结果与讨论

　　3.1  从56个引物中筛选出12个条带清晰、多态性明显的扩增产物分子量在200～2 000 bp之间的引物12个（见表2），共得到251个有效位点，其中引物S28、S180对样品的扩增结果见图1。经SPSS10.0分析软件得任意两样品间的相似系数（见表3）和聚类树状图（见图2）。

　　图1  S28，S180对样品扩增的产物电泳图谱（略）

　　图2  聚类树状图（略）

　　3.2  图2表明，样品4和5最先聚类说明其亲缘关系密切，相似系数最大（0.575）亦说明了这点，它们为水栀子的不同居群，但样品4的结果率远低于样品5，样品4生于江西中医学院药用植物园，周围没有水源，生境相对较干燥，且周围有较高的乔木遮挡部分阳光，而样品5生长于水沟两侧，周围是稻田，阳光和水分充足；样品4和5的差别可能是生态环境的不同而引起的。

　　表2  本实验所用引物序列（略）

　　表3  样品之间相似系数矩阵（略）

　　3.3   表3表明，样品1和样品3相似系数为0.574，样品1与样品2的相似系数为0.421，样品1与样品4相似系数为0.477，遗传距离计算公式［8］为：DS=1－SI，DS为遗传距离，SI为相似系数，相似系数越大，遗传距离越小，亲缘关系则越近。与样品1栀子相似系数比较，样品3重瓣栀子（0.574）＞样品4水栀子（0.477）＞样品2雀舌栀子（0.421），样品1～4均采自江西中医学院药用植物园，它们的生长环境一致，说明它们的差异来自物种内部。实验表明，重瓣栀子与栀子亲缘关系最近，雀舌栀子与栀子的亲缘关系最远。从形态上看，雀舌栀子为矮小灌木，叶小，花小且为重瓣，这些特征与其它种差别很大，图2聚类结果亦表明雀舌栀子与另几种关系较远。
   
　　【参考文献】
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　　［3］ 吴修仁. 广东药用植物简编［M］. 广州: 广东高等教育出版社，1989：450.

　　［4］ 徐国钧. 中药材粉末显微鉴定［M］. 北京: 人民卫生出版社，1986：472.

　　［5］ 中国科学院植物研究所. 江苏南部种子植物手册［M］. 北京: 科学出版社，1959：706.

　　［6］ 谢宗万.全国中草药汇编，第2版(上册)［M］.北京:人民卫生出版社，1999：766 .

　　［7］ 付小梅，赖学文，葛 菲，等. 中药栀子类药材资源调查和商品药材鉴定［J］. 中国野生植物资源,2002,21(5):23.

　　［8］ 吕雪梅, 杨关福, 张细权. RAPD分析中遗传距离计算方法的比较［J］. 华南农业大学学报,1997,18(增刊):90.