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【摘要】 目的优化考察转基因西洋参冠瘿组织中多糖提取条件。方法用正交设计法优选西洋参冠瘿组织中多糖的最佳提取工艺，选取提取温度、加水量、提取时间和提取次数四个考察因素。结果正交实验结果显示：西洋参冠瘿组织中多糖的最佳提取工艺：提取温度为70℃，40倍溶剂，提取3次、3 h/次。结论优选得到的工艺简单易行，稳定性好。
【关键词】 西洋参； 冠瘿组织； 多糖； 提取； 优化
Optimization of Extraction Methods of Polysaccharides Constituents from the Crown Gall Cultures of Panax quinquefolium
Abstract：ObjectiveTo investigate the extraction methods of polysaccharides constituents from the crown gall cultures of Panax quinquefoliums. MethodsThe orthogonal test was employed to optimize and establish the extraction technology of water-soluble polysaccharides from the crown gall of P. quinquefolium.ResultsWhen employed 70℃ of extracting temperature, 40 times of water, refluxing and extracting for 3 times, 3 hours for every turn, the optimal extraction efficacy was obtained. ConclusionExtraction method optimized will be used for the isolation and purification of polysaccharides from the transgenic crown gall cultures of P. quinquefolium.
Key words：Panax quinquefolium； Crown gall； Polysaccharides； Extraction； Optimization
西洋参Panax quinquefolium L. 又称洋参、花旗参、西洋人参，为五加科人参属草本植物, 原产于美国东部和加拿大，多年生宿根，属名贵药材，具有补气生血、生精养神之功效。现代化学和药理学研究表明，西洋参具有提高免疫力、强心、健胃、降血脂、镇静、造血和抑制肿瘤生长等作用，且其某些药理作用是人参无法替代的。其主要活性成分为皂苷类、多糖类和氨基酸类成分。为临床抗疲劳、抗衰老、抗癌的滋补佳品［1，2］。野生或栽培西洋参生长缓慢，5～6年才能入药，故西洋参药材市场供应偏紧且价格较贵。
20世纪60年代以后，人们逐渐发现多糖在抗肿瘤、抗病毒、治疗心血管疾病、抗衰老等方面有着独特的生物活性，其作用多数是通过免疫系统来实现的。目前人们已从天然产物中分离提取出300多种多糖类化合物，其中从药用植物中提取的水溶性多糖最为重要，已发现有100多种中药中的多糖类化合物具有免疫促进作用。这类多糖没有细胞毒性且药物质量通过化学手段容易控制，已经成为当今新药开发的主流方向之一。
西洋参多糖(Polysaccharide from Panax quinquefolium, PPQ)、西洋参皂苷(Panax quinquefolium saponin, PQS)及西洋参复方合剂的免疫药理作用研究是科学家们关注的焦点。如PPQ对环磷酰胺(Cyclophosphamide, CY)所致的外周血白细胞减少有明显保护作用，并能拮抗CY作用下的胸腺、脾脏重量降低，增强正常及免疫低下小鼠网状内皮系统的吞噬功能［3，4］；增加小鼠的非特异性免疫和细胞免疫功能，其免疫增强作用随剂量增加而增强，具有一定的量效关系［4］。另有报道西洋参果实中的多糖提取液对肥胖小鼠有降血糖作用，可以治疗糖尿病，但不改变其体重［5］。
随着分子生物学的发展，将基因工程用于组织培养中生产代谢产物颇引人关注。其中利用发根农杆菌的Ri质粒和根瘤农杆菌的Ti质粒转化形成转基因器官（如毛状根和冠瘿瘤）方面的研究较多，从而为植物代谢产物的生产开辟了新的途径。转基因西洋参冠瘿组织培养及其皂苷类成分的产生已由本研究组进行了较系统研究［6～10］，但西洋参冠瘿组织培养物中多糖的研究尚未见报道。本文在前期工作基础上，报道西洋参冠瘿组织中多糖提取条件的优化考察。
1 仪器和材料
1.1 材料转基因西洋参冠瘿组织由本研究组转导所得。系由胭脂碱型根癌农杆菌C58菌株感染诱导西洋参茎，获得冠瘿组织，并经多年筛选驯化形成稳定、优良的培养体系［7］。
1.2 仪器与设备TDL80-2B离心机；东京理化N-1000旋转蒸发仪；丹麦Heto MAXI- DRYPLUS冷冻干燥器；日本SHIMADZU公司UV-2450紫外可见分光光度计；德国Sartorius ACCULAB ALC-110.4电子天平。
2 方法
2.1 西洋参冠瘿组织多糖提取条件的单因素分析影响西洋参冠瘿组织多糖提取的因素很多，本实验选取与提取效果直接相关的提取温度、加水量、提取时间、提取次数这4个因素分别在不同水平上进行分析以确定正交实验的最佳因素水平。
2.1.1 提取温度的选择取样品按样品量50倍加水量，提取时间3 h，在不同的温度（40，50，60，70，80，90，100℃）下提取。
2.1.2 加水量样品在提取温度为70℃，提取时间3 h条件下，选用不同的加水量（10，20，30，40，50，60倍水）提取。
2.1.3 提取时间取样品按50倍加水量，提取温度为70℃，按提取时间长短（1，2，3，4，5 h）进行提取。
2.1.4 提取次数样品在提取温度为70℃，50倍加水量，提取时间3 h条件下提取1，2，3，4，5次。
2.2 正交实验法优选西洋参冠瘿组织粗多糖提取工艺
2.2.1 正交实验设计选取用水量、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素拟定3个水平（表1）,选用L9（33）正交设计表。
表1 正交实验因素水平（略）
2.2.2 多糖含量的测定称取重蒸苯酚12.5 g，置于250 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解定容至刻度，摇匀，避光冷藏，即得5%的苯酚溶液。
标准曲线的制备［11］：配制100 μg/ml的葡萄糖溶液：精密称取干燥至恒重的标准葡萄糖25 mg，加水溶解，置于250 ml容量瓶中，定容。分别量取 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml葡萄糖溶液于10 ml容量瓶中，补水至2 ml（以2 ml水作为空白对照），分别加1 ml 5%苯酚溶液，并迅速加入5 ml浓硫酸，置于50℃水浴中保温15 min，取出冷却至室温。加水定容至刻度，摇匀。于490 nm处测定吸收度。以葡萄糖浓度对吸收度作图，得标准曲线。
Y = 57.809X + 0.048 24 (r = 0.998 6)
样品检测［12］：待测样品制备：将收获的冠瘿组织用蒸馏水冲洗3次，以去除表面琼脂，置于烘箱烘干（< 60℃）至恒重，研细，称取0.5 g粗粉于250 ml圆底烧瓶中，加100 ml 80%乙醇，回流提取1 h，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次。滤渣再转入100 ml水中煮沸1 h，趁热过滤，热水洗涤，滤液连同洗液转入250 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得待测样品。
量取待测样品0.2 ml，加1.8 ml水, 1 ml 5%苯酚溶液，并迅速加入5 ml浓硫酸，置于50℃水浴中保温15 min，取出冷却至室温。然后加水定容至刻度，摇匀。于490 nm处测定吸收度。并将所得吸收度代入标准曲线，得样品溶液糖浓度。
多糖含量（mg/g）= 样品溶液糖浓度(μg/ml) × 1 250 / (1 000 × 0.5) × 100%
2.2.3 稳定性实验取葡萄糖标准溶液0.5，1.0，1.5 ml按“标准曲线的制备”项下操作显色，每隔10 min测定吸收度，结果90 min内吸收度基本保持恒定，表明稳定性较好。
2.2.4 样品溶液的制备精密称取烘干至恒重的西洋参冠瘿组织粉末1.00 g，加入50 ml 80%乙醇，回流1 h，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次，滤渣按正交表中条件提取，趁热抽滤，残渣及烧瓶用热水洗涤两次，合并滤液和洗涤液。旋转蒸发仪浓缩至50 ml左右，加入等容积的Sevag溶剂，分液漏斗萃取，取上层液体。紫外分光光度计扫描，无蛋白吸收峰，用恒压漏斗逐滴加入乙醇（95%）至整个溶液中含醇量达到80%，滴加过程中用磁力搅拌器搅拌，待沉淀完毕，停止搅拌，静置，倾出上清液，沉淀水浴挥干残余溶剂。加适量蒸馏水溶解沉淀，移至250 ml容量瓶中定容，作为样品溶液。
2.2.5 样品溶液多糖含量的测定分别吸取各样品溶液0.1 ml于10 ml容量瓶中，补水至2 ml（以2 ml水作为空白），分别加入1 ml的5%苯酚溶液，迅速加入5 ml浓硫酸，置于50℃水浴中15 min，取出冷却至室温。加水定容至刻度，摇匀。于490 nm处测定吸收度。
2.3 粗多糖的提取将约190 g的药渣粉碎后装入圆底烧瓶中，8倍体积80%乙醇，回流3次，1 h/次，趁热过滤，滤渣用80%热乙醇洗涤3次，风干。然后加入40倍体积蒸馏水浸泡药渣，70℃提取，共3次，2 h/次，纱布过滤，滤液静置过夜，离心15 min（3 000 r/min），合并上清液，减压浓缩至原来体积的1/10。 2.4 Sevag法除蛋白质［13］向多糖浓缩液（V）中加入1/5 V体积的氯仿和1/25 V体积的正丁醇，振荡20 min，离心（3 000 r/min）15 min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述步骤，如此操作5～7次，至氯仿层与正丁醇层之间无白色浆状物。
2.5 三氯乙酸法除蛋白［14］配制15％的三氯乙酸溶液，用其调节浓缩液的pH值至3，4℃静置过夜，沉淀部分为蛋白，转速为4 000 r/min，20 min/次，离心2～3次至无沉淀，取上清液。
2.6 乙醇沉淀上清液加95％的乙醇至乙醇体积分数为50％，离心20 min（4 000 r/min），收集沉淀，用95％乙醇洗涤，再依次用丙酮和乙醚洗涤，抽滤, 得粗多糖PPQ50。上清液继续加95％乙醇至体积分数分别为70％，沉淀同上处理，得粗多糖PPQ70。将所有组分进行冷冻干燥。
2.7 多糖得率的计算多糖得率（％）＝ （多糖质量／原料质量）×100％。
3 结果
3.1 西洋参冠瘿组织多糖提取条件的单因素分析
3.1.1 提取温度的影响提取温度50～80℃时，多糖得率逐步升高，随后趋向稳定，100℃达到最高。但根据多糖提取原则，其提取温度宜低，提取条件宜温和，以防止高温时糖苷键断裂，所以确定提取温度为70℃。见图1。
图1 提取温度对多糖得率的影响（略）
3.1.2 提取液体积的影响样品在提取温度为70℃，提取时间3 h下，改变加水量10，20倍时，多糖得率缓慢增加，到30～40倍时，得率趋向稳定。因此确定正交实验中加水量3水平为20，30，40倍水。见图2。
3.1.3 提取时间的影响50倍加水量，提取温度为70℃，分别提取1，2 ，3 h，多糖得率迅速升高，3 h达到最高。当时间继续增加时，多糖得率略有下降。因此确定正交实验中提取时间为2，3，4 h。见图3。
3.1.4 提取次数的影响50倍加水量，提取温度为70℃，提取时间为3 h, 按不同的提取次数进行提取。提取3次的效果最好，提取4次或更多对多糖得率没有帮助。因此确定正交实验中提取次数为1，2，3次。见图4。
图2 加水量对多糖得率的影响（略）
图3 提取时间对多糖得率的影响（略）
图4 提取次数对多糖得率的影响（略）
3.2 正交设计实验结果见表2。
由正交设计实验结果可知，西洋参冠瘿组织中多糖的最优提取条件为，在70℃下，加40倍蒸馏水，提取3次，3 h/次。
表2 正交设计及其实验结果（略）
3.3 多糖收率多糖收率为：PPQ50：4.80％； PPQ70：3.12％。
3.4 两种除蛋白方法的比较Sevag法的原理是根据有机溶剂使游离蛋白质变性成为不溶性物质，通过离心除去蛋白的目的。三氯乙酸法的原理是根据蛋白质在pH ＜ pI时呈正离子，可与三氯乙酸结合成不溶性的盐而沉淀。实验过程中，曾用Sevag法（用氯仿:正丁醇4∶1混合）和三氯乙酸法进行测试比较。发现转基因西洋参冠瘿瘤组织含少量蛋白（在除蛋白操作过程中也体现出来，氯仿层与正丁醇层之间白色浆状物较少）。尽管Sevag法重复操作两次也可除掉蛋白，三氯乙酸法操作只需1次，考虑到后者对操作要求高，需在低温下进行，而且多糖在酸性环境下容易降解，不及Sevag法除蛋白条件温和，故本实验仍选用Sevag法除蛋白。
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发表于 2014-8-18 17:44:52
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