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作者：张振凌， 朱轩， 刘博， 吴国学， 张红伟
【摘要】 目的建立不同方法制酒萸肉饮片以及山茱萸饮片的高效液相指纹图谱并对其进行比较。方法高效液相法建立指纹图谱；指纹图谱处理软件计算相似度，并进行图谱比较。结果分别建立了加压蒸酒萸肉饮片和常用蒸酒萸肉饮片高效液相指纹图谱。不同产地、不同批次、同一炮制方法和工艺的山茱萸饮片指纹图谱相似度均大于0.9。山萸肉生品和酒萸肉饮片高效液相指纹图谱有一定差异。结论 高效液相指纹图谱可用于不同方法制酒萸肉饮片和山茱萸饮片的鉴别和质量控制。
【关键词】 山茱萸； 高效液相； 指纹图谱
山茱萸系山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，为临床常用名贵中药。目前对山茱萸饮片的质量控制上，多是采用有效成分或指标性成分的检测，而这样的质量控制方法并不能反映其完整的真实质量。采用中药指纹图谱来对其进行质量控制，可以较为全面地反映中药材及其饮片所含成分的真实情况，进而用于中药的鉴别和质量控制。为此我们对不同方法炮制的酒萸肉饮片建立高效液相指纹图谱，并对其进行分析和比较。
1 仪器和试药
1.1 仪器 LC20AT（SHIMADZU）；Thermo hypersil gold(4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱；工作站：CSLight ；检测器：SPD20A；METTER AE240电子天平（瑞士）；BS210S型电子天平。
1.2 试剂与样品
1.2.1 试剂 色谱乙腈；色谱醇；娃哈哈纯净水；其余均为分析纯。马钱素、莫诺苷、熊果酸由中国药品生物制品检定所提供，供指纹图谱参照用。
1 .2.2 样品及制备 山茱萸采自河南的巩义、白云山、郏县、南召、西峡、南阳、宛西及实验室陈品共10批样品，经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc干燥果肉。
1.2.2.1 常压酒蒸品 将山茱萸药材除杂后加黄酒闷润，蒸制5h，干燥，粉碎过2号筛备用。
1.2.2.2 加压酒蒸品 将山茱萸药材除杂后加黄酒闷润，置高压容器中加压蒸制，干燥，粉碎过2号筛备用。
2 不同方法制酒萸肉饮片HPLC指纹图谱的建立
2.1 供试品溶液的制备［1］ 精密称取样品粉末（过40目筛）0.5 g,加甲醇20 ml,水浴加热回流1 h,滤过，药渣再同法提取两次，滤过，合并3次滤液，低温挥去溶剂后用甲醇溶解并定容至25 ml，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，弃去初滤液约5 ml，取续滤液作为供试品。
2.2 对照品溶液的制备 精密量取莫诺苷、马钱素适量，加甲醇配制成浓度为50 μg/ml的溶液，即得。
2.3 流动相梯度的选择 经实验比较，0.1%磷酸水溶液与0.1%磷酸乙腈梯度洗脱，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰较多；分析时间70 min,70 min后无特征峰出现。
2.4 色谱条件 色谱柱： Thermo hypersil gold(4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：240 nm；分析时间：70 min；进样量；供试品和参照物各10 μl。
2.5 精密度实验 精密吸取各供试品溶液10μl各连续进样5次，均以马钱素峰作为参照峰，分别计算其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示不同制品山茱萸共有峰相对保留时间RSD小于3%和相对峰面积的RSD小于5%，表明在此方法下精密度良好。
2.6 重现性实验 分别精密称取常压酒蒸山萸肉、加压酒蒸山萸肉5份各0.5 g,按照制备供试品溶液的方法处理，分别进样5次，均以马钱素作为参照峰，分别计算其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示不同制品山茱萸共有峰相对保留时间RSD小于3%和相对峰面积的RSD小于5%，表明在此方法下重现性良好。 2.7 不同方法制酒萸肉饮片高效液相指纹图谱及技术参数以总峰面积中所占比重均较大且相对稳定的马钱素峰作为参照峰，山茱萸常压酒蒸品选取共有峰10个，山茱萸加压酒蒸品选取共有峰9个，分别算得相对保留时间和相对峰面积。结果见图1～2及表1～4。
图1 常压酒蒸 山萸肉饮片10批样品二维图（略）
图2 加压酒蒸 山萸肉饮片10批样品二维图（略）
从表1～2中可以得出，常压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对保留时间基本一致，共有峰相对峰面积差异较大。表明不同产地常压酒蒸山萸肉有效成分含量差异较大。
表1 常压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对保留时间（略）
表2 常压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对峰面积（略）
表3 加压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对保留时间（略）
表4 加压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对峰面积（略）
样品编号前两位“01～10”分别代表产地为巩义、白云山、郏县、南召A、西峡、南阳、南召B、实验室、宛西A、宛西B的样品，样品编号后两位为“02”代表常压酒蒸山萸肉饮片，样品编号后两位为“03”代表加压酒蒸山萸肉饮片。
从表3～4中可以得出，加压酒蒸山萸肉饮片指纹图谱共有峰相对保留时间基本一致，共有峰相对峰面积差异较大。表明不同产地加压酒蒸山萸肉有效成分含量差异较大。
2.8 不同方法制酒萸肉饮片指纹图谱相似度计算 采用指纹图谱处理软件对不同方法炮制的指纹图谱进行相似度处理， 结果见表5～6。
结果表明不同制品山萸肉饮片指纹图谱相似度均大于0.9。
2.9 不同方法制酒萸肉饮片指纹图谱镜像相关图谱见图3～5。
3 讨论
不同产地，相同炮制工艺的山茱萸高效液相指纹图谱相对保留时间较稳定，但相对峰面积变异较大。说明随产地不同，其所含化学成分含量也会产生差异，甚至于同一产地但因气候、生长环境不同等因素也会造成一定的差异。
表5 山茱萸常压酒蒸品指纹图谱相似度分析结果（略）
表6 山茱萸加压酒蒸品指纹图谱相似度分析结果（略）
图3 山萸肉与常压酒蒸山萸肉饮片镜像图谱比较（略）
图4 山萸肉与加压酒蒸山萸肉饮片镜像图谱比较（略）
图5 常压酒蒸山萸肉饮片与加压酒蒸山萸肉饮片镜像图谱比较（略）
山茱萸常压酒蒸品和加压酒蒸品的共有峰和特征峰完全相同，高效液相指纹图谱的保留时间和峰面积差异均不明显，说明二者化学成分基本一致，常压酒蒸炮制需要的时间比较长，而加压酒制炮制工艺明显缩短时间。
【参考文献】
［1］ 蔡宝昌,刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术［M］.北京：化学工业出版社, 2005：42. |
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发表于 2014-8-18 17:45:39
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