消斑颗粒质量标准的研究

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     作者：谭雯， 盛蓉， 郑琰， 谭睿， 呼梅

【摘要】  目的建立消斑颗粒的质量标准。方法应用薄层色谱法对消斑颗粒中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性鉴别；采用高效液相色谱法对颗粒中2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷进行了含量测定。结果薄层色谱斑点清晰，阴性样品无干扰；2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷在0.131～1.965 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 97，加样回收率在95%～105%之间，RSD为2.05%（n＝5）。结论 该方法简便且精确，重现性好，可以作为消斑颗粒的质量控制标准。

【关键词】  消斑颗粒； 薄层色谱法； 高效液相色谱法

　　The Quality Standard of Xiaoban Granules

　　Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Xiaoban Granules. MethodsPolygonum multiflorum Thunb. , Citrus reticulata Blanco , Angelica sinensis (Oliv.) Diels and Ligusticum chuanxiong Hort. were identified by thin layer chromatography , and the content of 2,3,5,4ˊ�睺etrahydroxystilbene��2�睴�拨陋睤�瞘lucoside were measured by High Performance Liquid Chromatography .ResultsChromatography speckles were clear , and the negative sample showed no interference ; 2,3,5,4ˊ�睺etrahydroxystilbene��2�睴�拨陋睤�瞘lucoside showed a good linear relationship at a range of 0.131～1.965 μg , r=0.999 97 , the recovery was between 95% and 105% , with RSD 2.05%（n＝5）.ConclusionThe method is simple and accurate with good reproducibility. It can be used for quality control of Xiaoban Granules .

　　Key words：Xiaoban Granules;   TLC;   HPLC
   
　　消斑颗粒由制何首乌、熟地黄、当归、川芎、陈皮等药组成，具有益气养血活血、滋阴填精补肾的功效，主要用于气血两虚型黄褐斑的治疗。为确保制剂质量，对制剂中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性薄层色谱鉴别，并选择君药制何首乌中所含2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷作为控制消斑颗粒质量的控制指标，采用高效液相色谱法测定其含量，建立了消斑颗粒中2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷的HPLC含量测定方法。

　　1  仪器和试药

　　1.1  仪器   HP��1100 高效液相色谱仪（惠普），惠普化学工作站，二极管阵列检测器，电子分析天平（十万分之一,STRTORIUS公司），AS10200超声波清洗器（50kHz）。

　　1.2  试药   硅胶G、硅胶H（青岛海洋化工厂）；甲醇、乙腈（色谱纯）；重蒸馏水；其余试剂均为分析纯；橙皮苷对照品，批号：721��9405；2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品，批号：110844��200505；何首乌对照药材，批号：934��9403；陈皮对照药材，批号：969��9201；当归对照药材，批号：927��9202；川芎对照药材，批号：918��9001；以上对照品及对照药材均由中国药品生物制品检定所提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  定性鉴别

　　2.1.1  制何首乌的薄层色谱鉴别  取本品5 g，加10 ml水溶解，用乙醚提取两次，20 ml/次，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取2次，20 ml/次，合并正丁醇液，水浴挥干，残渣加甲醇2 ml溶解，作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品5 g，同法制成制何首乌阴性供试品溶液。另取2，3，5，4ˊ-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。取何首乌对照药材0.25 g，加乙醇50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至3 ml，作为对照药材溶液。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μl分别点于同一以0.2%CMC�睳a为黏合剂的硅胶H薄层板上，以苯�惨掖迹�2∶1），苯�惨掖迹�4∶1）为展开剂(第一次展开3.5 cm,第二次展开7 cm)，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸硫酸溶液，加热至斑点清晰，日光下检视［1］。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，且阴性对照无相应斑点见图1。

　　2.1.2  陈皮的薄层色谱鉴别  取本品5 g，加醋酸乙酯超声提取两次，10 ml/次，合并醋酸乙酯提取液，水浴挥干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺陈皮的阴性样品5 g，同法制得陈皮阴性供试品溶液。取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。取陈皮对照药材0.3 g，加甲醇10 ml，加热回流40 min，滤过，滤液浓缩至1 ml，作为对照药材溶液［1］。吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各2 μl分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷�脖�酮�布状迹�5∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，且阴性对照无相应斑点见图2。

　　2.1.3  当归、川芎的薄层色谱鉴别  取本品15 g，加乙醚30 ml，超声处理10 min，分取乙醚液，挥至1 ml，作为供试品溶液。取缺当归、川芎阴性样品15 g, 同法制得当归、川芎阴性供试品溶液。取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 ml，超声处理10 min,分取乙醚液，挥至1 ml，作为当归对照药材溶液。取川芎对照药材0.5 g，加乙醚20 ml，超声处理10 min，分取乙醚液，挥至1 ml，作为川芎对照药材溶液。吸取对照药材溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μl分别点于同一以0.2%CMC�睳a为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷�泊姿嵋阴ィ�9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，且阴性对照无相应斑点见图3。

　　图1  制何首乌TLC鉴别 （略）   

　　图2  陈皮TLC鉴别（略）  

　　图3  当归、川芎TLC鉴别  （略）
                  
　　2.2  含量测定［2～3］

　　2.2.1  色谱条件  色谱柱为依利特ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈�菜�（25∶75），流速：0.6 ml/min，检测波长：320 nm，柱温： 20℃ 。

　　2.2.2   对照品溶液制备  精密称取2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品1.31 mg，置10 ml量瓶中，用稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。　2.2.3   供试品溶液制备  取本品约0.5 g，精密称定，置50 ml具塞锥形瓶中，加50%乙醇25 ml，称定重量，回流提取40 min，放冷后用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.2.4  线性关系考察  精密吸取2，3，5，4，�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品溶液 1，3，5，10，、15 μl，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积。结果见表1。以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，计算回归方程，并以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，见图4。

　　表1  线性关系考察结果（略）

　　图4  2，3，5，4ˊ-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷标准曲线（略）
   
　　回归方程：Y=3 781X﹣43.749 ，r=0.999 97  结果表明，2，3，5，4，�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷在0.131～1.965 μg的范围内呈良好的线性关系。

　　2.2.5   方法学考察

　　2.2.5.1   精密度实验  精密吸取供试品溶液5 μl，按上述色谱条件，重复进样5次，测定峰面积。结果见表2。
   
　　结果表明，供试品中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷峰面积的相对标准偏差小于2.0%，精密度良好。

　　表2  精密度实验结果（略）

　　2.2.5.2   重现性实验  取同一批供试品5份，按供试品溶液的制备方法制备，分别进样5 μl，测定峰面积。结果见表3。
   
　　结果表明，供试品中2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷含量相对标准偏小于2.0%，重现性良好。

　　表3  重现性实验结果（略）

　　2.2.5.3  稳定性实验精密吸取供试品溶液5 μl，于0，2，4，6，8 h分别进样，依次测定峰面积，计算相对标准偏差，结果见表4。

　　表4  稳定性实验结果（略）

　　结果表明，在8 h内，供试品溶液稳定性良好（RSD＝0.80%）。

　　2.2.5.4  专属性实验取二苯乙烯苷对照品溶液，何首乌对照药材溶液，缺何首乌阴性供试品溶液和供试品溶液，按照2.2.1色谱条件进行测定，结果见图5。

　　a��2，3，5，4，�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷

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　　图5  HPLC图谱（略）
   
　　结果表明，在上述色谱条件下，其他组分对2，3，5，4，�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷峰无干扰，分离良好。

　　2.2.5.5   加样回收率实验取已知含量的供试品约0.5 g，精密称定6份，置100 ml具塞锥形瓶中，分别精密加入1 ml 2，3，5，4，-四羟基二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品溶液（2.38 mg/ml），按照供试品溶液的制备方法操作得供试品溶液，按照上述色谱条件测定，并计算回收率，结果见表5。
   
　　结果表明，2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷平均回收率为100.69%，回收率在95%～105%之间，RSD＝2.05%，加样回收率良好。

　　表5   加样回收率实验结果（略）

　　2.2.6   样品含量测定  取本品3批，每批两份，取约0.5 g，精密称定，按照供试品溶液的制备方法，分别制成供试品溶液。分别精密吸取2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷对照品溶液（0.131 mg/ml）、供试品溶液各5 μl，按上述色谱条件测定，结果见表6。

　　表6  供试品中二苯乙烯苷含量测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  制何首乌为方中君药，主要含2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷，且方中其它药材无该成分，故选择2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷作为控制本品质量的指标成分。

　　3.2   在薄层色谱鉴别研究中，陈皮按照药典收载方法展开，斑点暗淡,Rf值较小，不易鉴别，根据橙皮苷的理化性质，将药典中0.5%氢氧化钠－硅胶G薄层板改为聚酰胺薄膜，斑点清晰，分离度较好，且Rf值合适。川芎和当归，两者均含有阿魏酸，易互相产生干扰，将其一起鉴别，结果阴性无干扰，斑点圆整、清晰。

　　3.3  在制何首乌含量测定中，分别考察不同提取方法、不同提取溶剂和不同提取时间对供试品溶液中2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷含量的影响，结果以50%乙醇回流提取40 min为最佳。
   
　　在色谱条件的优选中，对色谱柱、检测波长、流动相、柱温、流速进行了考察确定采用依利特ODS C18（150  mm×4.6 mm，5 μm）柱，波长320 nm，乙腈�菜�（25∶75）为流动相，柱温20℃，流速0.6 ml/min为测定条件。

　　3.4   在2，3，5，4�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷含量测定过程中，发现对照品溶液和供试品溶液在放置24 h后，含量有降解下降的趋势，故样品和对照品配制成供高效液相色谱测定用溶液后，应该在8 h内完成测定。
   
　　本研究应用薄层色谱法对消斑颗粒中制何首乌、陈皮、当归与川芎进行了定性鉴别，采用高效液相色谱法对颗粒中2,3,5,4ˊ�菜聂腔�二苯乙烯��2�睴�拨陋睤葡萄糖苷进行了含量测定，操作简便，结果准确，重现性好，可作为质量控制方法。

【参考文献】
  　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：122，132.

　　［2］ 刘 斌,王晓强，王 伟. 何首乌配方颗粒质量标准研究［J］.中药材，2003 ,26 (2) ：115.

　　［3］ 唐 斌，尚北城，张 青，等. 何首乌中二苯乙烯苷的含量测定［J］.西南国防医药，2004,14 (5) ：496