新疆软紫草中咖啡酸四聚体对照品的制备

amy54321 · 发表于 2014-8-18 18:12:35

作者：秦冬梅，买尔旦*马合木提*，贺金华

【摘要】  目的从新疆软紫草的丙酮水提取物中分离制备了咖啡酸四聚体对照品。方法经紫外光谱、红外光谱、核磁共振和质谱确定结构。结果其相关数据与文献一致，纯度为 98.11 ％。结论符合中药化学对照品含量测定要求，可作为高纯度咖啡酸四聚体化学对照品的制备分离方法。

【关键词】  新疆软紫草；咖啡酸四聚体；对照品

基金项目：新疆自治区高校科研计划科学研究重点项目

　Preparation of Caffeic Acid Tetramers Reference Substance from Arnebia euchroma

　　Abstract：ObjectiveTo prepare reference substance for quality control of Arnebia euchroma. Caffeic acid tetramers was extracted and separated from acetone water extraction of Arnebia echroma.MethodsChemical structure of the caffeic acid tetramers product was elucidated by ultraviolet spectrometry(UV),infrared spectroscopy(IR),nuclearmagnetic resonance(NMR) and mass spectrometry(MS). ResultsThe results were in agreement with the reference.The purity of the caffeic acid tetramers product was 98.11%. ConclusionThe method meets the reference substances of traditional Chinese medicines and can used to prepare and purify the active constituents from Arnebia euchroma.

　　Key words：Arnebia Euchroma;  Caffeic acid tetramers;Reference substance

　　新疆紫草Arnebia euchroma为紫草科Boraginaceae多年生草本植物，以根入药。紫草，始载于《神农本草经》，列为中品。味苦，性寒。有凉血、活血、解毒透疹之功效［1］。以往研究表明紫草具有抗病原微生物、抗炎及抗过敏、抗生育、解热、抗肿瘤、保肝、止血、降血糖、镇静和影响免疫功能等作用［2］。现代药理学研究证明，紫草丙酮水提取物具有抗HIV活性［3］。紫草主要含两类有效成分：一为脂溶性的萘醌类，二为水溶性的多糖、酚酸类［4］。咖啡酸四聚体（caffeic acid tetramers CAT）为紫草中重要的水溶性有效成分之一，在《中国药典》中还未收载，据报道，咖啡酸四聚体单钠和单钾盐具有明显的抗HIV活性［3］。我们从紫草中分离得到了咖啡酸四聚体（结构式见图4），经紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）和质谱（MS）分析，其相关数据与文献［3］一致，纯度为98.11％，符合中药化学对照品含量测定要求，可作为紫草质量控制的化学对照品。分离制备紫草水溶性活性成分对进一步揭示紫草药效的物质基础和开发新的天然药物具有十分重要的意义。

　　1  仪器与试药

　　Waters液相色谱仪(包括W600输液泵、W717自动进样器、W2996PDA检测器和脱气装置)；INOVA-400核磁共振仪；Agilent LC/MS DSL质谱仪；DK-S26型电热恒温水浴锅（上海精密实验设备有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；MCL-GEL CHP20P(日本三菱公司)；ODS-AC18(日本三菱公司)；Sephadex LH-20(日本三菱公司)；反相薄层层析板（Merch RP-F254S）。

　　实验用植物为新疆软紫草的干燥根，购于新疆参茸药业有限公司（批号：20050102），品种鉴定由新疆医科大学药学院生药/天然药物化学教研室帕丽达副教授完成。高效液相用甲醇（色谱纯），丙酮、正己烷、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇、甲酸为分析纯。

　　2  方法

　　2.1  咖啡酸四聚体的分离和提取采自新疆地区的新疆软紫草干燥根10 kg，粉碎,用正己烷回流提取3次，合并、回收正己烷，得到沉红色粘稠物。将紫草正己烷提取后的药渣，用70％丙酮回流提取3次，合并、回收丙酮，得水溶液层。浓缩水溶液层后，得到的提取物，依次用醋酸乙酯、正丁醇萃取。剩余的水层浓缩、冷冻干燥，得紫黑色粘稠膏状物240 g。将其依次用MCL-GEL CHP20P，Sephadex LH-20上分离后，再在ODS-AC18上，用不同浓度的甲醇水溶液梯度洗脱，分离得黄褐色粉末,即为待测样品。

　　2.2  纯度检查和含量测定

　　2.2.1 薄层色谱法反相薄层层析板（Merch RP-18F254S 5×7.5）精制的CAT用重蒸水溶解，用毛细管在反相薄层层析板点样，自然晾干后，放入3种展开系统中展开。3种展开系统按体积配制，乙腈水（2∶8）；乙腈水（3∶8）；乙腈甲醇水（1∶1∶8），取出晾干后在UV254 nm下观察斑点，供试品只有一个主斑点，比移值Rf分别为：0.756，0.675，0.805。见图1。

　　2.2.2  高效液相色谱法色谱条件：色谱柱Water Symmatry C18150 cm×4.6 mm；流动相：甲醇0.14甲酸水（29∶71）；检测波长252 nm；流速：1 ml/min；柱温：40℃。　精密称取咖啡酸四聚体，用甲醇配成浓度为0.22 mg/ml的样品溶液，均进样10  μl，样品显示为单峰，用归一化法计算含量为98.11%（保留时间为14.656 min）。见图2。
　　乙腈水（2∶8）    乙腈水（3∶8）乙腈甲醇水（1∶1∶8）

　　图1  咖啡酸四聚体三种展开系统TLC鉴别（略）

　　图2  咖啡酸四聚体的纯度测定色谱图（略）

　　2.2.3  二极管阵列检测器（PDA）纯度检查法该实验所用仪器为Waters液相色谱仪，W2996PDA检测器。在“2.2.2”项中色谱条件下，200～400 nm用PDA检测器记录色谱图，检查主成分峰的纯度。见图3。

　　图3  咖啡酸四聚体的三维光谱图（略）

　　3  结果

　　3.1  对照品的纯度检查色谱图见图2，结果表明，在供试品溶液的色谱图中，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和小于样品溶液主峰的面积（0.5%）。二极管阵列检测器的测定结果表明：主成分峰的纯度因子为985.985；五点光谱图完全重合，表明主成分峰为单一物质峰。

　　3.2  结构确认［3］定性鉴别  样品与三氯化铁乙醇溶液显色，阳性，提示结构中有酚羟基，溴钾酚蓝乙醇液原位薄层显色，结果提示化合物为有机酸的盐。

　　紫外光谱  样品的水溶液在252nm处有最大吸收。

　　IR光谱中σmaxKBr 3388 cm-1(OH)，1680 cm-1(H-C=O)，1588 cm-1(C=C)。

　　核磁共振1H NMR见表1。核磁共振13C NMR见表2。

　　质谱  分子离子峰（m/z717［M-H］-1）,与分子式C36H30O16相符。

　　以上UV，IR，NMR，MS光谱数据与文献报道值一致，确定该样品为咖啡酸四聚体，其纯度符合国家中药对照品纯度要求。

　　表1  核磁共振1H NMR（Me2CO-d6+D2O）,δppm（略）

　　表2  核磁共振13C NMR（Me2CO-d6+D2O）,δppm（略）

　　图4  咖啡酸四聚体的化学结构（略）

　　4  讨论

　　作为新疆紫草中的水溶性成分之一，咖啡酸四聚体的提取、分离、纯化及物理化学常数的测定，未见国内文献报道。本实验从紫草的丙酮水提取物中制备咖啡酸四聚体，纯度较高，方法成熟，可作为常规的制备方法。同时由于中药所含成分复杂，增加了提取、分离纯化的难度，尤其是水溶性成分的分离，有时结果的重复性较差。可采用适当的梯度洗脱方法可以解决。

【参考文献】
  　　［1］阴健.中药现代研究与临床应用，第1版［M］.北京:学苑出版社,1993:643.

　　［2］沈映君.中药药理学［M］.北京:人民出版社,2000:289.
　　
　　［3］ Kashiwada Y,Nishizawa M,Yamaagishi T,et al.Anti-AIOS agents,18:Sodium and potassium salts of caffeic tetramers from Arnebia euchroma as anti-HIV agents［J］.J Nat PROD,1995,58(3):392.

　　［4］黄志纾,张敏,马林,等.紫草的化学成分及其药理活性研究概况［J］.天然产物研究与开发,2000,12(1):73.

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