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【摘要】 目的确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计。方法采用2005版《中国药典》规定的验证方法。结果计数结果准确，符合要求。结论该实验适合保元排毒丸微生物限度检查方法的验证。
【关键词】 保元排毒丸 微生物限度检查方法 验证
从理论上来讲，每个样品对微生物都会有影响，影响的程度有多大，检验方法能否保证污染的微生物能够检验出来，要通过试验来验证，才能保证微生物限度检查结果的准确性，而药品质量监督抽验合格率存在不尽清晰、全面、真实的突出问题［1］。按照《中国药典》2005版前规定的微生物限度检验方法，有很多菌检不出，这就很难保证药品微生物限度检验结果的准确可靠，也给临床使用带来隐患。保元排毒丸系我院著名老中医张志坚主任医师长期临床实践经验方。临床用于慢性肾炎，慢性肾功能衰竭，见有头昏乏力，神疲肢软，尿少足肿，腰膝酸痛，纳呆泛呕，夜不能寐，面色晦暗，舌淡嫩，苔薄黄腻等病症，临床使用较广， 因此必须保证保元排毒丸微生物限度检验结果的准确可靠。
1 器材
1.1 仪器设备净化工作台，SWCJICU （苏净集团安泰公司）；生物安全柜，BHC1300ILA/B3（ 苏净集团安泰公司）；电子天平，AV412 梅特勒托利多公司（上海有限公司）；隔水式恒温培养箱PYXDHS，（上海一恒科技有限公司）；霉菌培养箱，MJ180SⅡ（上海新苗医疗器械制造有限公司）；立式灭菌器， LMQ.R3260B（山东新华医疗器械制造有限公司）。
1.2 培养基营养琼脂培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司（20060309）；玫瑰红钠琼脂培养基，宜兴市永信生物有限公司（050915）；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，宜兴市永信生物有限公司（051027）；胆盐乳酸培养基 ，宜兴市永信生物有限公司（050509）；营养肉汤培养基 ，宜兴市永信生物有限公司（051206）；甘露醇高盐琼脂，青岛高科园海博生物技术有限公司（20060112）；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 ，宜兴市永信生物有限公司（050921）；改良马丁培养基 ，宜兴市永信生物有限公司（050829）。
1.3 验证用菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44 102］， 第4代；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26 003］，第4代；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ［CMCC(B)63 501］，第4代；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC(B)10 104］，第3代；白色念珠菌(Candida albicans) ［CMCC(F)98 001］第4代；黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC(F)98 003］第3代。
1.4 供试品及试剂保元排毒丸（060810），江苏省常州市中医医院制剂；氯化钠溶液，分析纯。
2 方法
2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证［2］
2.1.1 供试液制备取供试品保元排毒丸10 g，加pH无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，于45℃水浴中保温，浸泡，振荡溶解，制成1∶10的供试液。
2.1.2 菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，30～35℃培养24～48 h，分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含50～100个cfu（菌落数）的菌液。
将白色念珠菌的新鲜培养物分别接种至改良马丁培养基中，置23～28℃培养箱中培养24～48 h，取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含50～100个cfu的菌液。
将黑曲霉的新鲜培养物分别接种至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养7 d，使大量孢子产生。再加入5 ml0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10 ml吸管吸出孢子液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌液稀释至每毫升含50～100个cfu的菌液。
2.1.3 验证方法 平皿法（常规法）。
实验组:取10个平皿，2个一组分成5组，分别做好大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的标记。 各取1∶10供试品保元排毒丸1 ml,分别加入10个平皿中，再依次加入上述5种菌的菌悬液1 ml(50～100个cfu),每株菌平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h，测定试验组的菌数。
菌液组：分别取上述稀释的菌液1 ml，注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h，测定所加的试验菌数。
供试品对照组 ：各取1∶10供试液保元排毒丸1 ml分别注入4个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h，以测定供试品的本底数。
稀释剂对照组：本品未采用特殊方式处理和制备，故未做。上述方法平行实验3次。
菌回收率计算：实验组的菌回收率（%）=（实验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100%
实验结果：见表1。
2.2 控制菌检查方法的验证［2］
2.2.1 大肠埃希菌检查方法的验证
实验组：取1∶10的供试液10 ml，接种至100 ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入47 cfu/ml大肠埃希菌1 ml，35～37℃培养18～24 h，取上述培养液0.2 ml接种至5 ml MUG培养基的试管内，培养5，24 h，在345 nm紫外线下观察，均见荧光反应，滴加靛基质试液，液面呈玫瑰红色。
阴性菌对照组：取1∶10的供试液10 ml，接种至100 ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入66 cfu/ml金黄色葡萄球菌1 ml，35～37℃培养18～24 h，取上述培养液0.2 ml接种至5 mlMUG培养基的试管内，培养5，24 h，在365 nm紫外线下观察，均无荧光反应，滴加靛基质试液，液面呈试剂本色。
2.2.2 大肠菌群检查方法的验证
实验组：取1∶10的供试液1 ml，接种10 ml胆盐乳糖发酵培养基管内，加入47 cfu/ml的大肠埃希菌1 ml，置35～37℃培养18～24 h。培养基出现混浊，产酸产气。
表1 保元排毒丸细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定（平皿法）（略）
阴性菌对照组：取1∶10的供试液1 ml，接种10 ml胆盐乳糖发酵培养基管内，加入66 cfu/ml的金黄色葡萄球菌1 ml，置35～37℃培养18～24 h。未见产酸产气。
2.2.3 沙门菌检查方法的验证
实验组：取10 g的供试液直接接种至200 ml的营养肉汤培养基中，加入含66 cfu/ml金黄色葡萄球菌1 ml，置35～37℃培养18～24 h，取上述培养液1 ml，接种至10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24 h，划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基的平板上，培养18～24 h，平板上生长出无色，半透明，菌落中心为暗色的菌落。
阴性菌对照组：取10 g供试品直接接种至200 ml的营养肉汤培养基中，混匀，加入含66cfu/ml金黄色葡萄球菌1 ml，置35～37℃培养18～24 h，取上述培养液1 ml，接种至10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24 h，划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基的平板上，培养18～24 h，平板上无菌落生长。
3 讨论
由表1可见保元排毒丸用平皿菌落计数法，3次平行实验中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落回收率都达到了70%以上，说明该方法用于细菌、霉菌及酵母菌计数结果是准确的。
控制菌检查方法的验证实验说明：实验组检出了大肠埃希菌，乙型副伤寒沙门菌；阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌；乙型副伤寒沙门菌。说明保元排毒丸对大肠埃希菌无抑制作用，对大肠菌群无抑制作用，对沙门菌无抑制作用。
本品稀释剂对照组未作特殊方式处理和制备，对细菌无损伤，故未做验证。
在制备需测定菌落数的菌液过程中，经过实验摸索本实验室每种菌的稀释级别为：金黄色葡萄球菌10-6，白色念珠菌10-5，大肠埃希菌10-7，枯草芽孢杆菌10-5，黑曲霉10-5，正好符合实验菌落数50～100 cfu/ml或10～100 cfu/ml的要求。
【参考文献】
［1］ 姜 红. 药品监督抽验合格率与药品质量（Ⅰ） ［J］.中国药事，2005，19(1)：17.
［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录71，附录73. |
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发表于 2014-8-19 16:33:30
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