Caco-2细胞模型及其在食品营养物质吸收研究中的新进展

amy54321 · 发表于 2014-8-19 19:31:34

【摘要】  概述了Caco-2细胞系的特点、模型的建立与验证，及其在营养物质吸收及机制研究中的新进展，并评价了其用于营养物质吸收转运中的优点与局限性。

【关键词】  Caco-2细胞营养物质吸收

　　Caco-2 Cell Model and Development of its Application to Absorption of Food Nutrients

　　　Abstract：This article overviewed the characteristics of Caco-2 cell, establishment and validation of Caco-2 cell model. The research development of the mechanisms of absorption and transport of nutrients extensively was also reviewed. This model has many advantages, as well as few disadvantages.

　　Key words：Caco-2 cell;  Nutrients;  Absorption

对于营养物质在人体内的吸收转运及其生物利用度，不同的动物之间、动物与人之间都存在或大或小的质的差异。这种种属间的差异使得动物实验数据不能完全地外推至人体，并且直接利用人体组织进行研究是非常有限的。人类细胞培养系统作为肠屏障的体外模型的应用是模拟营养物质透过小肠黏膜的机制与影响因素的一个有效的方法。它可采用人体或与人体最接近的生物材料，从而消除了动物模型和人体的巨大差异；有利于探讨营养物质动力学-结构的定量构效关系的特点；有高通量、节省时间、节省资金、有利于对组合代谢产物进行分析的特点。近十几年来，国外已普遍采用组织细胞模型作为营养物质吸收研究的工具，包括有Caco-2细胞(the human colon adenocarcinoma cell lines)单层模型、MDCK细胞模型、MDR1-MDCK 细胞模型及ECV304细胞模型。其中尤其是Caco-2细胞模型以其与体内营养物质，特别是那些被动吸收的营养物质研究的良好相关性，被普遍用于营养物质开发的早期快速筛选过程中［1，2］。

　　1  Caco-2细胞模型概述

　　1.1  Caco-2细胞系及其特征

　　Caco-2细胞系于20世纪70年代首次分离自人类结、直肠癌细胞，Caco-2细胞模型最初是由Borchardt 和WorkeM在1989年提出的［3］。以普通的培养条件培养成熟的Caco-2细胞即可形成与小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织，如图1所示,其形态和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(apical，肠腔侧，又称黏膜剂)和基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧，又称浆膜剂)。

AP面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质的转运载体，可发挥主动转运物质的作用，如糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B内源性因子的主动转运载体在Caco-2细胞都有表达；存在于小肠细胞刷状缘的酶，如氨肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶及γ-谷氨酰转肽酶也同样存在于Caco-2细胞；I相代谢酶CYP1A1及Ⅱ相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶在该细胞系统的表达也都有报道［4］。

由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似，Caco-2细胞模型已被广泛地应用于体外营养物质分子肠吸收的研究。

　　1.2  Caco-2细胞模型的建立

　　1.2.1  Caco-2细胞的培养［5，6］将Caco-2细胞置于常规培养瓶内，以DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s  Medium)为培养液：含4.5g·L-1D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠和碳酸氢钠，1%非必需氨基酸、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清，pH值为7.2。在37℃、5%CO2气流下进行培养，隔1天更换1次培养液，每5天按1:3比例传代。

当细胞长至覆盖瓶底的80%～90%时，用含0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液消化。按2×105个/ml接种于Transwell上(为一种具有0.3 μm孔径的聚碳酸酯膜0.5 ml/孔，起支持Caco-2单层细胞的作用)。在Transwell的下腔加入培养液1.5 ml，如图2所示。接种后每两天换液1次，1周后每天换液。一般将第25～35代（培养21 d，满足跨膜电阻TEER300～500·cm2。）的Caco-2细胞用于吸收和代谢研究［7］。

　　1.2.2  Caco-2细胞模型的验证［8］为了确定Caco-2细胞单层是否建立，通常采用以下几个指标测定其完整性：①细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接)，用电子显微镜或光学倒置显微镜进行形态学上的检查；②可在单细胞层培养的不同阶段，测定小肠刷状缘细胞标志酶—碱性磷酸酶的活性；③Caco-2细胞单层的跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，一般为300～500·cm2；④采用甘露醇、荧光黄、PEG4000等荧光或放射性漏出标记物测量单细胞层的跨膜通量；⑤用辣根过氧化物酶测定Caco-2细胞的胞饮功能［9］。

　　1.2.3  Caco-2细胞用于实验的操作步骤取Caco-2细胞合格的细胞培养插件，用Hanks缓冲液冲洗掉表面的代谢物，最后1次洗涤后孵育30 min测定单细胞层的跨上皮电阻等指标来控制细胞质量。根据研究目的，在细胞层的AP(或BL)侧（供池）的培养液中加入适量浓度用Hanks液溶解的待测营养物质，BL(或AP)侧（受池）中加空白Hanks液，放入培养箱中进行细胞培养实验，定时从BL(或AP)侧（受池）培养液中取样，用一定灵敏的分析手段检测营养物质含量或破碎细胞测定细胞中营养物质含量［10］。

　　2  Caco-2细胞模型在营养物质吸收及机制研究中的应用

　　2.1  营养物质吸收实验参数Artursson和Karlsson等［11］对不同转运途径的20多个化合物进行了研究，得出了在人体口服后经细胞和细胞旁路被动扩散的药物透过Caco-2细胞单层的转运速率［表示为表观渗透系数(apparent permeability coefficients，Papp)］，Papp可由下式计算：Papp=△Q△t·A·C0

其中△Q/△t为受池侧待测物质出现的速率，也就是渗透速率(μg·min-1)，为细胞单层表面积(cm2)，为给池侧的初始物质浓度。

　　2.2  Caco-2细胞模型在营养物质吸收研究中的应用

　　2.2.1  研究营养物质结构与吸收转运的关系了解化学结构对营养物质小肠吸收的影响，可大大促进有效营养物质吸收的研究。因此通过Caco-2细胞模型测得的Papp值与营养物质化学结构之间建立的联系，可以更快地合成转运性质较好的营养物质。

Kaeko Murota等［12］利用Caco-2细胞研究大豆异黄酮苷元比其相应的糖苷更有效地被Caco-2细胞吸收，可能是由于其对细胞膜亲脂性强于其糖苷。并且不同于黄酮类苷元，异黄酮类苷元可以完整的形态被转运到基底外侧（B侧），可能与B环在联苯丙烷结构的位置有关。

　　2.2.2  预测营养物质的体内吸收被动扩散营养物质的生物利用度与表观渗透系数间有良好的相关关系，可用于预测被动扩散的营养物质的生物利用度。如表1所示。表1  表观渗透系数与生物利用度之间的关系（略）

　　2.2.3  评价营养物质前体的吸收对于一些脂溶性差而造成生物利用度低的营养物质，可将其进行结构修饰，制成营养物质前体而增强营养物质分子的细胞通透性。在体内多种组织包括小肠上皮，营养物质前体被酶水解为活性成分而发挥作用。

Chureeporn Chitchumroonchokchai等［13］利用Caco-2细胞研究玉米黄质及其酯类前体的吸收表明，其酯类前体在小肠消化吸收过程中被其中羧基酯酶水解，并促进了玉米黄质的吸收。

通常营养物质的酯类前体可以增强营养物质分子的吸收，且在体内多种组织包括小肠上皮，营养物质的酯类前体可被酯酶水解为活性成分。

　　2.2.4  研究营养物质相互作用对吸收的影响对于脂溶性差或分子量大的营养物质如多肽类营养物质，其黏膜透过性较差，因而体内吸收较差，可利用营养物质之间的相互作用以提高营养物质通过肠黏膜吸收的能力，从而提高其生物利用度。

人体从食物中摄取营养物质，对铁的吸收较差，铁缺乏性疾病非常普遍，如缺铁性贫血等。因而利用各种方法、因素促进铁吸收的研究相对较多。Raymond P. Glahn等［14］研究表明，半胱氨酸、还原性半胱氨酸-甘氨酸可促进铁的吸收，谷胱甘肽可经消化成半胱氨酸，还原性半胱氨酸-甘氨酸也有相同作用。

还有研究［15］表明二果糖酐III（DFAIII）、二果糖酐IV（DFAIV）、低聚果糖、棉子糖通过控制细胞的紧密连接增加胞旁转运，从而提高了Caco-2细胞中钙的净吸收。

　　2.2.5  研究胃肠道消化作用对营养物质吸收的影响肠腔pH和胃肠道的酶类直接影响营养物质吸收，采用体外模拟消化与Caco-2细胞模型相结合，进行营养物质转运的研究，模拟营养物质吸收的生理环境，可以更准确地预测其在体内的生物利用度。

Jeanelle Boyer等［16］利用胃蛋白酶、（猪）胰酶/胆汁、乳糖酶与Caco-2单层培养模型相结合研究了槲皮素及其葡糖苷的吸收情况，认为这一模型是非常可靠的研究食品中黄酮类物质生物利用度的体外模型。

Shumei Yun, Raymond P.等［17，18］也都利用体外模拟消化与Caco-2细胞相结合研究提高了铁的生物利用度，与动物实验结果具有很好的相关性，证实了这一模型的可行性。　2.3  Caco-2细胞模型在营养物质吸收机制研究中的应用通常，营养物质跨过肠上皮细胞有3种主要途径：①跨细胞转移；②胞旁转运；③载体介导转运。

　　2.3.1  Caco-2细胞模型用于被动转运的研究90%以上的物质主要通过被动扩散进入体内［19］。这些营养物质的脂溶性好，油水分布系数大，易分布于上皮细胞脂质膜。吸收缓慢且较差的营养物质，如亲水性营养物质以及多肽等，主要经胞旁转运。而细胞旁间隙仅占肠管表面积的0.1～0.01，且紧密连接是转运的限速因素，因此胞旁转运对营养物质吸收的贡献是有限的。

　　2.3.2  Caco-2细胞模型用于载体介导主动转运的研究除了被动转运，载体介导的主动转运在营养物质的吸收过程中也起重要作用。Caco-2细胞有3种主动转运载体［20，21］：①二肽载体；②P-糖蛋白；③寡肽载体。这些载体主要转运营养物质(氨基酸、葡萄糖、胆酸等)及与营养物质结构类似的化合物。因此，Caco-2细胞模型也可用于载体介导主动转运营养物质吸收机制的研究。

　　2.4  Caco-2细胞模型在营养物质代谢方面的应用营养物质经肠吸收进入血液循环系统前，在肠腔、刷状缘或（和）肠壁细胞内均可能被代谢。

Caco-2细胞含有许多小肠上皮细胞中包含的酶，因此可以用来评价营养物质的代谢稳定性。

Yan Liu等［22］研究表明，5,7,4'-三羟基异黄酮及其同系物的生物利用度低，不是因为其吸收差，而是因为小肠内广泛存在的Ⅱ相代谢酶的代谢作用。

　　3  Caco-2细胞模型应用于营养物质吸收转运中的优点与局限性

Caco-2细胞模型作为营养物质吸收研究的一种快速筛选工具，能够在细胞及分子水平提供关于营养物质分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运的信息；细胞分化的极性有助于研究营养物质双向（肠腔侧肠壁侧或肠壁侧肠腔侧）的转运率，从而对主动转运的营养物质进行研究；各种转运系统及代谢酶在Caco-2细胞的表达，使该模型的研究结果与体内营养物质的处置有较好的相关性；Caco-2细胞来源于人体，不会造成各种药动学性质的种属差异，其结果有较好的重现性；Caco-2细胞模型的实验条件，如转运介质的pH值及营养物质浓度比较容易控制。与动物实验相比，培养细胞要比培养动物更省时更经济。若用于营养物质的研究，细胞模型的费用要少得多。

Caco-2细胞模型的局限性在于：分化的Caco-2细胞单层中的紧密连接比在小肠上皮细胞中更具特征性，其TEER值比正常小肠上皮细胞高；Caco-2细胞由于缺乏分泌黏液的杯状细胞，因而缺乏小肠上皮中的黏液层；Caco-2细胞中某些特别的酶（细胞色素P450的一些同工酶）的活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gP在Caco-2细胞中表达的波动性对结果有不同程度的影响；Caco-2细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低，因而在主动转运营养物质的研究方面相对不如被动扩散营养物质研究的成功［23］。

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