中药砷剂（三氧化二砷）抗肝癌作用的研究进展

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【摘要】  实验与临床研究已证实中药砷剂(As2O3)能有效治疗急性早幼粒细胞性白血病，有关As2O3抗实体瘤的研究已成为目前抗肿瘤的研究热点之一，抗肝癌作用的研究报告日益增多，本文参考国内外文献，就As2O3抗肝癌作用的实验研究和临床应用进展进行综述。

【关键词】  三氧化二砷 肝癌 抗肝癌作用 细胞凋亡

　　Advances in Antihepato Eellular Carcinoma of Arsenic Trioxide

　　Abstract：Clinical trials have demonstrated that arsenic trioxide is effective in the treatment of acute promyelocytic leukemia．Based on this fact，more and more studies have been carried out to study its role in the treatment of human hepatocarcinoma cells． Thus we review overseas and domestic literature and summarize treatment of hepatocellular carcinoma with arsenic trioxide for experiments and clinical study．

　　Key words：Arsenic trioxide；  Hepatocarcinoma;  Antihepatocellular carcinoma；  Cellular apoptosis
   
　　人类最早用于治疗恶性肿瘤的化学药物可能就是砷剂(三氧化二砷As2O3)， 砷剂是中国传统中药砒霜的主要有效成分，长期以来被认为是有毒和致癌物，但作为药物应用已有二千四百多年历史,作为抗肿瘤药在我国至少有百年的历史［1］。近年研究发现，As2O3对急性早幼粒细胞性白血病(APL)具有诱导细胞凋亡的作用，进一步证实砷剂能够抑制胃癌、肺癌、前列腺癌、肝癌等实体瘤的瘤细胞生长，提示砷剂是广谱抗肿瘤药物［2］。自发现该药对肿瘤细胞有诱导分化和促进凋亡作用以来，围绕其抗癌机制进行了大量的研究，特别是抗实体肿瘤的研究目前仍是方兴未艾，并取得了突破性进展。原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 预后较差, 病死率逐年增高, 是影响我国人民健康的重大疾病，故加强对肝癌的研究具有重大意义［3］。现就砷剂抗肝癌作用的基础与临床研究进行综述。

　　1  砷剂抗肝癌作用机制研究

　　1.1  砷剂诱导肝癌细胞凋亡诱导肝癌细胞凋亡可能是As2O3 抗肝癌主要作用之一。细胞凋亡(apoptosis)是多基因调控的细胞程序化主动死亡，包括诱导期、效应期和降解期。诱导期细胞接受许多信号发生多种效应，效应期受调控分子作用细胞主动进入程序化死亡，降解期最后可见凋亡结果。凋亡对机体保持自身稳定，调控细胞增殖和肿瘤发生、预防及治疗有着重要作用，因此促进细胞凋亡是治疗肿瘤的有效途径，能够改善肿瘤患者的预后。实验研究表明，As2O3诱导肝癌细胞凋亡是多路径、多靶点的复杂过程，包括激活Caspase酶，活化凋亡基因，影响巯激酶活性，促进融合蛋白降解，作用线粒体膜降低跨膜电位等［4］ 。砷剂引起细胞凋亡的机理可能是砷与蛋白质和氨基酸分子中的巯基具有较强的亲和性，能影响巯基酶的活性或直接与蛋白质的巯基结合，使蛋白质灭活，引起细胞代谢异常，发生细胞凋亡［5］。国外研究报道：As2O3药物敏感性与凋亡率、药物效果与肿瘤细胞凋亡阈值有一定关系；As2O3通过影响不同基因，实现诱导多个肝癌细胞株凋亡的作用。因此As2O3诱导细胞凋亡是其抗肝癌作用的重要机制之一。刘湘国等［5］ 发现经As2O3作用后的BEL-7402细胞，在琼脂糖电泳中出现了典型的DNA凋亡条带，用流式细胞仪检测出了典型的凋亡峰，电镜下观察到了典型的凋亡细胞形态学改变：如细胞核仁消失，染色质浓缩、碎裂，聚于核膜边缘并形成凋亡小体。

    有关砷剂诱导肝癌细胞凋亡的途径有多种报道。苏颖等［6］研究发现一定浓度As2O3可影响细胞周期动力学，使SMMC-7721肝癌细胞阻滞于G-M期，阻止细胞有丝分裂，从而延长细胞周期时间，使细胞发生凋亡。王晨龙等［7］研究认为As2O3可能通过启动凋亡基因bcl家族、caspase-3蛋白表达、提高细胞活性氧水平等方面的机制而促使肝癌细胞凋亡。细胞凋亡相关基因的表达水平改变也是As2O3诱导肝癌细胞凋亡的主要途径之一。张霞等［8］研究发现As2O3在诱导SMMC-7721肝癌细胞发生凋亡的同时，p21蛋白表达水平增高，而抑制细胞凋亡的基因cyclin D1，cyclin A蛋白表达水平明显下降。吴顺华等［9］提出As2O3下调抑凋亡基因Bc1-2，增加促凋亡基因Bax的表达以及改变两者之间的比例，促使促凋亡基因Fas基因的表达增强，促进其凋亡。而李江涛等［10］认为bax基因与细胞凋亡有关，Bcl-2与As2O3诱导肝癌细胞凋亡过程无关。热休克蛋白的改变在细胞凋亡中也起一定作用，张宇阳等［11］研究发现As2O3，作用于BEL-7402细胞后，细胞应激产生Hsp70和Hsp40，二者形成复合体，可以防止细胞凋亡；但As2O3同时又刺激Hspl05 B的大量表达，后者对Hsp40和Hsp70复合体进行负向调节，使细胞向凋亡方向发展。目前有关As2O3 促肝癌细胞凋亡的机制报道较多，实验结果存在较大差异，哪种机制起主要作用，是否多种机制共同参与 ，还有待进一步研究。

　　1.2  砷剂抑制肝癌细胞的增殖细胞生长周期有G1/S和G2/M 两个转换限制点，其中G1/S转换决定细胞周期时间。细胞周期素cyclinD1，激酶CDK4 和P16，Rb等CDK抑制蛋白在G1/S转换调控中起重要作用，CDK4 与cyclinD1 结合而被激活，使Rb蛋白磷酸化，促进E2F等转录因子释放，结果G1/S转换促进因子表达增加，细胞通过G1/S限制点进入S期。砷剂能够影响细胞周期两个转换限制点G1/S和G2/M，抑制肝癌细胞增殖。任玮玮等［12］研究As2O3对肝癌BEL-7402细胞生长作用时发现，在0.5～2.0μmol／L As2O3作用下，肝癌细胞BEL-7402的生长受到抑制，且有时间和剂量依赖性。随着As2O3 浓度的增加，其对BEL-7402细胞的生长抑制作用越明显，产生作用所需时间也越短。Makoto等［13］研究As2O3对SK-Hep-1，Hep-G2， HuH7肝癌细胞发现，As2O3对3种肝癌细胞均有抑制作用，且呈时间-剂量依赖关系，尤其对HuH7肝癌细胞抑制作用较强，在2.0 μmol／L As2O3时抑制率达50％以上。刘骏达等［14］研究认为As2O3对肝癌细胞线粒体跨膜电位△Ψm 的损伤可能是其引起肝癌细胞的增殖抑制和凋亡的作用机制之一。

　　1.3  砷剂抑制血管内皮生长因子(VEGF)的生成肿瘤血管生成是肿瘤恶性生长、浸润和转移的形态学基础，且与预后密切相关。血管内皮生长因子(VEGF)是作用最强、特异性最高的可溶性血管增生因子，广受重视。国内外研究表明VEGF与肝癌生长关系密切，可作为一项反映肝癌复发转移潜能的生物学指标。肿瘤组织中，由于内皮和血管生成障碍，使肿瘤细胞缺少营养和氧气供给，生长变缓，直至凋亡和坏死，肿瘤新生血管能够提供丰富的营养来满足肿瘤细胞迅速生长的需要，因此肿瘤内皮和血管生成可促进细胞增殖。研究发现砷剂能够抑制肿瘤新生血管形成，直接诱导内皮细胞和白血病细胞凋亡，或者干扰两者间互相促进的环式作用，以剂量及时间依赖方式，诱导内皮细胞凋亡，使细胞血管生成因子(VEGF)表达下降，最终肿瘤细胞生长受抑。国外学者报道：As2O3作用于肝癌细胞，使VEGF和bcl-2表达降低，诱发癌细胞凋亡。国内文献显示在大鼠肝癌移植瘤As2O3治疗中，可见细胞VEGF合成减少，肿瘤血管生成障碍，肿瘤细胞增殖受抑，中剂量As2O3效果显著且无不良反应［15］。华海清等［16］的鸡胚尿囊膜实验研究表明：无论是正常鸡胚绒毛尿囊膜的血管生长还是接种肿瘤细胞后的血管生长， As2O3均有较显著的抑制作用，且疗效略优于目前认为有抗肿瘤血管形成作用的国家一类新药人参皂苷 ，其抑制肿瘤血管形成可能是通过抑制VEGF的表达和破坏内皮细胞的结构和功能实现的。崔永安等［17］研究表明SMMC-7721肝癌细胞未加药组，VEGF基因表达较强(++)，经As2O3，作用后VEGF表达受到抑制。说明As2O3 通过下调VEGF的表达，影响VEGF的信号通路来抑制肿瘤血管形成，控制肿瘤细胞的生长。

　　1.4  砷剂抑制端粒酶活性端粒酶与肿瘤发生发展的密切关系已经使其成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。端粒酶是细胞增生所必须的，端粒酶在肿瘤细胞中起重要作用，其功能是添加重复序列于DNA端粒末端，促进癌细胞无限增生。Kobayashi等［18］发现端粒酶在原发性肝癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织。任玮玮等［19］研究发现0.5μmol/L As2O3作用于BEL-7402细胞时，可显著抑制其端粒酶的活性，而对于SMMC-7721肝癌细胞则需较高浓度(1.0～2.0μmol/L)才能抑制其端粒酶活性。并指出As2O3对这两种细胞的差异性是由于两种细胞内谷胱甘肽(GSH)含量不同所致。楼芳等［20］通过研究也发现经As2O3作用后的肝癌细胞株SMMC-7721和QGY-770肝癌细胞的端粒酶活性显著降低，端粒酶活性抑制程度存在时间量效关系。

　　1.5  提高机体的细胞免疫功能抗肿瘤免疫效应一般以细胞免疫为主，淋巴细胞亚群是机体的主要抗肿瘤免疫细胞，它不仅直接介导细胞免疫功能，而且对机体免疫的调节起关键作用。一般认为CD8 T细胞(细胞毒T细胞)在杀伤肿瘤细胞中起主要作用，CD4 T细胞(辅助T细胞)在肿瘤免疫中起重要的辅助作用，CD4+/CD8+比值可直接反应出机体的细胞免疫功能状态。唐印华等［21］研究证实As2O3能提高肝癌小鼠的CD4+含量和CD4/CD8 的比值，从而能够改善和提高机体的细胞免疫功能。

　　1.6  砷剂逆转肿瘤多药耐药性多药耐药是临床化疗治疗恶性肿瘤面临的一个棘手问题，如何逆转恶性肿瘤的多药耐药性成为近年来抗恶性肿瘤的研究热点，而寻找多药耐药逆转剂被作为逆转多药耐药性的主要突破口。研究发现As2O3具有体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用，可能与下调MDR1表达、增加细胞内药物积累有关。李贺等［22］研究As2O3逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用时发现As2O3在0.25 mg/L 剂量以下时对HepG2和HepG2/ADM耐药细胞株的抑制率均小于15％，半数抑制率(IC50)分别为1.02和1.34 mg/L，无细胞毒剂量0.2 mg/L的As2O3能部分逆转HepG2/ADM细胞对阿霉素、顺铂(CDDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性，逆转倍数分别为2.92，3.09，2.13 ,2.60倍。同时无细胞毒剂量0.2 mg/L的As2O3 能使HepG2/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加 MDR1表达下降。

　　2  砷剂抗肝癌作用的实验研究

    国内已有砷剂抗肝癌的动物研究报道。覃筱燕等［23］研究表明：低，中浓度As2O3治疗肝癌实体瘤小鼠的瘤体重量明显减小，抑瘤率分别达：39.3％ 和24.4％ ，与对照组相比有显著差异(P<0．01和P<0.05)；高浓度As2O3，治疗肝癌实体瘤小鼠的瘤体重量减小不明显，与对照组相比无显著差异(P>0.05), 同时发现治疗量的As2O3对骨髓造血功能无抑制作用。Hong等［24］研究发现As2O3，剂量在2.5 mg/kg时对小鼠肝癌肿瘤的抑制率第5天53.42％，5 mg/kg剂量时对小鼠肝癌肿瘤的抑制率第5天79.18％，第l0天96.58％，两组小鼠用药后均未出现肝肾功能损害，也无血象的异常改变， AFP在用药后明显下降。Bing等［25］研究表明应用As2O3 治疗肝癌实体瘤小鼠的瘤体重量明显减轻，特别是As2O3剂量在1 mg/kg剂量时(P<0.01)；并证实在1 mg/kg量时肝癌细胞生长受到明显抑制，肝癌细胞出现广泛凋亡，G0/G1期肿瘤细胞明显增多，VEGF表达降低等改变。目前有关As2O3 抗肝癌实体瘤的实验研究不是很多，现有资料表明，As2O3 确实能抑制肝癌肿瘤的生长，但何种剂量能最有效抑制肝癌生长，且不引起严重毒副反应，尚无统一认识，还有待进一步研究。

　　3  砷剂联合抗肿瘤药物的协同作用研究

    有研究表明砷剂与抗肿瘤药合用有协同作用，如As2O3与肿瘤坏死因子联合应用对抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖有协同作用。宋铁芳等［26］研究发现单用As2O3及As2O3加rhTNF-α组均可抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖，且抑制作用随浓度的升高和作用时间的延长而增强。但单用rhTNF-a培养初期(24 h内)有短暂的促HepG2生长的作用，在两药合用时可被As2O3 抑制，表现出两药合用的优越性；而且在培养后期(24h后)，其表现出更强的协同作用，抑制率高于As2O3组，差异有显著性(P<0.05)。罗俊卿等［27］研究发现As2O3与5-Fu和MMC联用对肝癌细胞HepG2的杀伤率明显高于三药单用组。汤秀红等［28］也发现As2O3与顺铂联用时抑制率较单用其中一种药物时高，且有效浓度降低，避免了单药高浓度时的毒副反应。肖建兵等［29］ 建立小鼠肝癌H22移植瘤模型，观察As2O3 联合全反式维甲酸(ATRA)的体内抑瘤作用；用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定As2O3联合ATRA在体外对小鼠肝癌H22细胞株的生长抑制作用。发现As2O3和ATRA在体内和体外对H22肿瘤细胞的生长均有抑制作用，联合应用作用加强，有协同作用。As2O3联合ATRA在体外能明显抑制H22细胞的生长和增殖，抑制率为52.24％ ；在体内对H22小鼠的肿瘤体积、重量均有明显的抑制作用，抑制率分别为66.25％，62.07％。李媛等［30］研究发现As2O3与VitC联用能显著提高单用As2O3对HepG2肝癌细胞抑制率和细胞凋亡率(P<0.05)，VitC能显著增强As2O3 诱导细胞集中于S期的作用，从而增强其促细胞凋亡作用。以上均提示As2O3与其他化疗药物有协同作用，能够降低化疗药物的使用剂量，从而减少了化疗药物的毒副反应的发生，也可以减缓多药耐药的产生，为临床的肿瘤治疗提供了一条新的途径。　　4  砷剂的临床应用研究

    近年来，As2O3应用于治疗原发性肝癌也有了很大突破。临床试验和应用的结果显示，As2O3的抗肝癌等多种消化道肿瘤作用有着诱人的前景［31］。秦叔逵与南京中医药大学、哈尔滨血液肿瘤研究所合作攻关，将砒霜提纯精制成注射液，通过静脉给药，以提高血液和肿瘤内药物浓度，最大限度减少毒性，攻关小组经过临床试验，治疗晚期肝癌患者30例，取得明显疗效，无肝、肾毒性及骨髓抑制。江伟等［32］使用三氧化二砷注射液7～8 mg/m2加人生理盐水或5％葡萄糖液500 ml静滴，1次/d，连用14 d，间歇2周为1周期，至少使用2周期。治疗中晚期原发性肝癌20例, 根据WHO1981年制定的标准进行疗效评估,取得全组2例PR，5例MR，8例SD，PD5例，客观有效率10％。临床受益疗效：疼痛缓解阳性率为50％；70％患者生存质量提高；行为状态阳性率为60％；体重变化阳性率为40％。治疗后血清AFP下降，治疗前后比较有显著性差异(P<0.05)，治疗后CD3，CD4，CD8以及CD4/CD8值有明显提高，治疗前后比较有显著性差异(P<0.05)。全组毒副反应轻微。陈峰等［33］用0.1％As2O3注射液，10 mg加入5％葡萄糖液或生理盐水500 ml中，静脉滴注3～4 h，1次/d，连续10 d为1周期，间歇3周重复。根据WHO1981年制定的标准进行疗效评估：取得全组CR 0例，PR 3例(20％)，NC 8例(53.3％)，PD 4 (26.7％)例，其中先介入治疗后再静脉全身治疗3例病人中，PR 1例，NC 1例，PD 1例。KPS评分升高20分者1例 (6.7％)，升高10分者7例(46.7％)，无变化者5例(33.3％)，下降2例(13.3％)。项颖等［34］采用As2O3 (10 mg/d，连续14 d为1个疗程，间歇14 d再重复一疗程)静脉滴注治疗16例原发性肝癌也取得相似的疗效，全组毒副反应少且轻微。As2O3注射液动静脉双路治疗中晚期原发性肝癌取得较好的近期疗效。陈丽军［35］采用0.1% As2O3注射液30 ml经肝动脉插管注入 (d1)，0.1% As2O3注射液10ml加入5％G S 250 ml每日1次静脉滴注(d2～d10) 治疗中晚期原发性肝癌30例。21天为1周期，至少治疗2周期。按1981年WHO制订的标准进行疗效评价。全组CR 2例(6.6％)，PR 5例(16.6%)，NC17例(56.6%)，PD 6例(20.0%)。RR 23.3%。KPS评分提高20分者5例(16.6%)、提高10分者16例(53.3%)、无变化5例(16.6%)，下降4例(13.3 %)。以上均说明As2O3 应用于肝癌治疗有一定的临床价值，能够使肿瘤体积缩小，改善患者食欲，增加患者体重，减轻肝区疼痛等，提高患者生活质量，且毒副反应轻微。这些都说明As2O3，应用于临床肝癌治疗存在着广阔的前景。

　　5  毒副作用

    砷剂为剧毒药，其毒性反应不但与剂量和机体敏感性有关，而且与接触方式有关，应用含巯基的还原型谷胱甘肽可阻断砷剂的毒性作用。有文献报道口服砷剂常常导致急性出凝血机制障碍，误服者“七窍流血”而亡；治疗剂量静脉滴注多为轻度的不良反应［13］，主要表现为恶心、呕吐及手足麻木等，部分出现轻度肝肾功能损害，对症治疗或不治疗，短期可缓解或恢复正常，未见急性中毒。钱军等［36］在30个月的时间内用As2O3注射液治疗1例肝癌患者累积剂量已达3 850 mg，有的白血病患者长期用药，累积剂量高达6 000 mg，仍未见明显的慢性砷中毒，这可能与其静脉滴注后迅速与红细胞内血红蛋白结合，在血浆内分布较快并可直接从肾脏排出有关。

　　6  问题与展望

    砷剂抗肝癌作用的研究，从体外观察、建立动物模型在体内实验到最后临床实验及应用于晚期肝癌的治疗，取得了一定疗效，从而奠定了As2O3 临床治疗肝癌等实体瘤的基础。通过近年来对As2O3 抗肝癌的机制进行纵深的研究，目前多数学者认为As2O3诱导肝癌细胞凋亡是其主要机制，但在诱导肝癌细胞凋亡的途径上存在较大分歧，有的研究结果甚至相反，故有关抗肝癌机制仍需进一步研究。在临床应用上，虽然已有As2O3 用于肝癌治疗的临床报道，有一定的治疗价值，但还没有大样本随机、双盲、对照研究，也未有对As2O3能否提高患者生存期的随访研究，以更好地评价其治疗效果。可以相信，伴随着砷剂治疗肿瘤分子机制的进一步明了和临床经验不断积累，砷剂将会有更加广阔的应用前景而最终可能成为抗肝癌的一线用药。



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