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【摘要】 目的 筛选适合分离和纯化大蓟总黄酮的大孔吸附树脂并确立纯化工艺参数。方法以吸附及解吸率为指标考察4种型号的树脂，确定纯化大蓟黄酮的最佳树脂。并通过单因素分析考察该树脂分离、纯化大蓟总黄酮的最佳工艺条件。结果AB8吸附率及解吸率均高于其他3种树脂。其具体工艺条件为控制上样浓度5.2 mg/ml、流速0.5 ml/min，上样体积3.5BV，洗脱剂浓度为80%，洗脱剂用量10BV。结论 AB-8型树脂在所确定的工艺条件下，纯化大蓟总黄酮效果良好，总黄酮得率可达近90%。
【关键词】 大蓟 总黄酮 大孔吸附树脂
Study on the Separation and Purification of Total Flavone from Herb Cirsii japonici by Macroporous Absorption Resin
Abstract:ObjectiveTo select the suitable resin and establish the optimal conditions for separation and purification of total flavone from herb Cirsii japonici. MethodsTo determine the optimal one by inspection of four types of macroporous resin. The optimal process of purification was studied by single factor analysis .ResultsThe static absorption capacity, the absorption ratio and the static elution ratio of AB-8 resin was higher than the others . The optimal technological conditions were found in AB-8 as follows：sample concentration was 5.2 mg/ml，flow rate was 0.5 ml/min，sample volume was 3.5BV ,and 80% ethanol was used as eluting agent and its dosage was 10BV. ConclusionThe type of AB-8 showed comprehensive property in the condition and the yield of the total flavones achieved nearly 90%.
Key words:Herb Cirsii japonici; Total flavone ; Macroporous absorption resin
大蓟为菊科植物蓟 Cirsium japonicum Fisch. ex DC．的干燥地上部分或根，具有凉血止血、祛淤消痈的功能［1］。大蓟中含有多种化学成分［2］：黄酮、黄酮苷、生物碱、挥发油和谷甾醇等，其中黄酮类化合物柳穿鱼叶苷为主要止血活性成分［3］。
大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，大孔吸附树脂分离技术从20世纪70年代末冯孝章等人对天麻化学成分的研究开始，目前已广泛用于中药活性成分如黄酮、皂苷、生物碱、苷类等成分的分离与纯化。本实验通过对4种不同型号大孔吸附树脂进行筛选，确定AB-8型树脂对大蓟黄酮有较高吸附及解吸率并通过实验确定了利用该大孔树脂分离纯化大蓟黄酮的最佳工艺条件。
1 试药与仪器
大蓟提取液（自制）；芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所，含量测定用，批号0080-9705)；D101型、AB-8型、RAR-9型及HPD一450型树脂(陕西蓝深吸附交换材料有限责任公司生产)； U-3000紫外分光光度计（日本HITACHI公司）。化学试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 对照品的制备精密称取芦丁对照品0.020 14 g,置100 ml容量瓶中,加60%乙醇适量，振摇溶解后稀释至刻度，摇匀即得。
2.2 样品的制备
取大蓟药材适量，用6倍量70%乙醇回流提取两次，2 h/次，回收乙醇，过滤，加水定容至1 000 ml，静置24 h，备用。
2.3 芦丁对照品标准曲线的绘制［4］
分别取上述芦丁标准溶液0，0.5 ，1，2，3，4，5 ml于10 ml容量瓶中，加入0.6 ml 5% NaNO2溶液，摇匀。静置6 min，加入0.6 ml 10% Al(NO3)3 溶液，摇匀，6 min后加入3ml 8.6% NaOH溶液，摇匀．用60%乙醇稀释定容至刻度，于波长505 nm处比色测定(以零管为空白)。结果见图1。
2.4 总黄酮含量的测定
准确量取1 ml样品于10 ml容量瓶中，按“2.3”测定其在505 nm处的吸光度。然后在芦丁标准曲线上查出相应的类黄酮含量。测试液中总黄酮的含量按以下公式计算：
总黄酮浓度Po=y
式中：y为芦丁标准曲线上相应的浓度（mg/ml）。
2.5 树脂的预处理
用重蒸水洗去细小树脂及破碎树脂，湿法装柱后，用高于树脂层10 cm的无水乙醇浸泡24 h，放出浸液，继续用无水乙醇冲洗至洗出液加水(1∶5)不出现浑浊，再用重蒸水洗至无醇味，备用。
2.6 树脂的筛选
2.6.1 静态吸附行为考察
分别称取已处理好的4种型号的树脂：AB-8，RAR-9，D101及HPD450型大孔吸附树脂各2.00 g（湿重）于100 ml具塞三角瓶中，加入样品溶液30 ml，20℃下振摇2 h，静置24 h过滤，吸取过滤后样品液按2.4法测定吸附平衡后溶液中总黄酮浓度。按下式计算静态饱和吸附量及吸附率。结果见表1。
静态吸附容量 E =(Po-Pa)Va/M(单位：mg/g)
吸附率 s=(Po-Pa)/Po
式中：Po ---样品溶液中总黄酮的初始浓度：mg/ml；Pa-- 吸附平衡后溶液中总黄酮浓度：mg/ml； Va：样品液体积(ml)
M：树脂量（g）
2.6.2 静态洗脱行为考察
取上述经静态饱和吸附总黄酮后滤出的树脂，取20 ml纯净水洗20 min后用滤纸吸干表面水分，精密加入95%乙醇30 ml，不时振摇，持续5 h，测定洗脱液的浓度，按下式计算各型号树脂的解吸率。结果见表1。表1 4种饱和树脂的静态饱和吸附量吸附率及解吸率（略）
解吸率=［洗脱液浓度×洗脱液体积］饱和吸附量×100%
由上述结果表明，4种树脂中AB-8具有较好的静态吸附率及解吸率，均高于其他3种树脂，而HPD450具有较好的解吸率，但其吸附率太低，故在本次实验中选择AB-8 型树脂来纯化和富集大蓟中黄酮类成分。
2.7 动态吸附行为的考察
2.7.1 吸附流速的确定
取适量样品液分别以0.5，1，2，3 ml/min的流速上样，收集各流速下的流出液，分别测定各流出液中总黄酮含量，按“2.6.1”计算吸附率。结果见表2。表2 吸附流速的确定（略）
由上述结果可知：吸附速度是影响吸附率的一个重要因素，慢速有利于吸附。当流速过快时，黄酮成分尚未被完全吸附就随吸附液流出，为保证吸附完全故选择吸附速度为0.5 ml/min。
2.7.2 吸附浓度的选择
分别取四份浓度为6.33，5.20，3.76，1.25 mg/ml的样品以0.5 ml/min的速度上样，待吸附完全分别测定流出液中总黄酮吸附率。结果见图3。
由图可知：随着浓度的增大，吸附率也有所提高。但浓度为6.33 mg/ml时，样品液太稠，几乎成浸膏状，反而不利于其扩散和吸附。故选择样品液上样浓度5.20 mg/ml。
2.7.3 泄漏曲线的绘制
取浓度为5.2 mg/ml的样品液200 ml,以0.5 ml/min的速度加入至200 g（湿重）树脂柱中，测定其树脂床体积为40 ml。分段收集流出液，每10 ml为1份，分别测定其总黄酮含量，绘制泄漏曲线。见图3。
从泄漏曲线可知：大蓟总黄酮从第14份处开始泄漏，此时肉眼可看出样品色带移至柱底端。样品液至18份处达到吸附平衡。故可确定在浓度为5.2 mg/ml时，溶液上样体积为3.5倍树脂床体积时为佳，超过此比例会发生泄漏。
2.7.4 洗脱剂浓度的选择
精密称取5份AB-8型树脂2g(湿重)，分别置带塞锥形瓶中，加样品液20 ml，充分吸附后，分离树脂，晾干，对应加入浓度分别为10%，30%，60%，80%，95% 的乙醇各20 ml，不时振摇，持续5 h，测定洗脱液浓度，计算洗脱率，结果见表3。表3 洗脱剂浓度的选择（略）
2.7.5 洗脱液体积的选择
按上述确定的吸附和洗脱条件，待样品液吸附完全后用重蒸水洗至无色或颜色不再变浅为止，取80%乙醇液600 ml开始洗脱树脂，分段收集洗脱液。每15 ml收集一份，共40份。测定洗脱液中黄酮含量，以每份流出液体积为横坐标，相应浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。结果见图4。
从图4中可知，第26份洗脱液开始总黄酮的含量已趋近洗脱平衡，可认为树脂柱上样吸附的总黄酮已完全达到洗脱平衡，故确定洗脱剂用量为10BV（该树脂床体积为40 ml）。
由表3可知，用95%乙醇洗脱树脂柱时，乙醇洗脱物中大蓟黄酮含量最高，但80%乙醇洗脱液浓度与其相差不大，从经济角度考虑，故在本实验中选定80%乙醇为洗脱剂。
2.7.6 验证实验
取大蓟样品液按上述方法选择的工艺条件进行吸附和洗脱，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算总黄酮得率为89.53%。
在动态吸附过程中，药液首先与柱的上部树脂接触，并首先达到吸附饱和状态，然后这种饱和吸附状态逐渐向下推移，构成色谱带，当全部树脂吸附到一定程度 ，待分离开始泄漏时，停止吸附，这是达到吸附的最佳过程［5］。
在实验中发现，除了选用性能优良的大孔树脂外，还应配合最佳工艺条件，如最佳吸附流速，样品液的上样浓度等，这些都直接影响到富集黄酮类成分的效果。
为达到更好的纯化目的，梯度洗脱也许更能发挥作用，需要结合TLC或HPLC定位目标化合物进一步考察。
4 结论
AB-8型树脂为弱极性树脂，适合大蓟黄酮的分离和纯化。由实验可知：当上样浓度为5.2 mg/ml,控制上样流速为0.5 ml/min,上样体积为3.5 BV时吸附效果较好，用10BV80%乙醇洗脱后，总黄酮得率近90%。因此本方法可以用来分离纯化大蓟中黄酮类成分。
【参考文献】
［1］肖培根．新编中药志，第3卷［M］.北京：化学工业出版社，2001：5.
［2］植 飞，孔令义，彭司勤．中药大蓟的化学及药理研究进展［J］.中草药,2001,32(7)：664.
［3］Ishida H .Chem Pharm Bull,1987,35(2)：861.
［4］倪晓霓，赵宏阳，杭太俊. 大蓟、小蓟中黄酮类成分的不同提取方法及含量测定［J］.江苏药学与临床研究, 2005,13(1)：33.
［5］冯年平，郁 威. 中药提取分离技术原理与应用［M］.北京：中国医药科技出版社，2005：109. |
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发表于 2014-8-19 19:59:17
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