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【摘要】 目的建立照山白中金丝桃苷的高效液相色谱法。方法采用DiamonsilTM C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)色谱柱，以甲醇-5%磷酸溶液-三乙胺（44∶56∶0.37）为流动相，检测波长为360 nm，流速为1.0 ml/min。结果金丝桃苷在0.05～0.28 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 8，n=6）,平均回收率为99.83%（n=5）, RSD为0.90%。结论该方法快速、简便，结果准确，可用于照山白中金丝桃苷的质量控制。
【关键词】 反相高效液相色谱 金丝桃苷 照山白
RPHPLC Determination of Hyperin in Manchurian rhododendron Leaf
SUN Heying，FU Pingping，HAO Na
1.School of Medicine, Hebei University，Baoding, Hebei 071000, China；
2. Baoding Institute for Drug Control，Baoding，Hebei 071051, China；
3.Baoding Sanjiu Biopharmaceutics Co.，Ltd.，Baoding 072656, China
Abstract:ObjectiveTo establish an RPHPLC method for the determination of Hyperin in Manchurian rhododendron Leaf.MethodsThe DiamonsilTM C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) was used. The mobile phase was methanol-5%phosphoric-triethylamine（44∶56∶0.37）.The flow rate was 1.0ml/min,the detective wavelength at 360nm.20μl sampler and external method were used. Results A satisfactory separation was obtained.The calibration curve was linear over the range of 0.05～0.28μg for ribavirin（r=0.999 8，n=6）.The average recovery of ribavirin was 99.83%（n=5）with RSD of 0.90%.ConclusionThe method is quick and simple with good reproducibility. It can be used for the quality control of Hyperin in Manchurian rhododendron Leaf.
Key words：RPHPLC； Content determination； Hyperin； Manchurian rhododendron Leaf
照山白为双子叶植物药杜鹃花科植物小花杜鹃的枝叶或花，具有祛痰止咳、通络止痛等功效，可用于治疗急慢性气管炎、哮喘、痛经、产后周身疼痛等病症，其主要成分为各种黄酮类成分，如金丝桃苷及多种皂苷及多糖类等［1］。有报道应用高效液相色谱法，以甲醇－3%醋酸溶液等为流动相，测定山楂等不同药材中金丝桃苷的含量［2～4］。本实验采用RPHPLC法，以甲醇5%磷酸溶液三乙胺为流动相，实现了对照山白中金丝桃苷的准确分析。现报道如下。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，515泵，2487紫外检测器, plus717自动进样器，浙江大学色谱工作站；Sartorius BP211D 电子天平。
金丝桃苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：1521200202）；照山白（保定医药药材公司提供）；甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为DiamonsilTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-5%磷酸-三乙胺（44∶56∶0.37）；检测波长为360 nm；流速1.0 ml/min；进样量20 μl；室温进样。在上述色谱条件下，金丝桃苷峰形良好，无杂质峰干扰，以金丝桃苷计算的理论塔板数大于5 000，保留时间约为15 min，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，见HPLC图。
2.2 实验溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷对照品11.60 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.232 mg/ml的溶液；分别精密量取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 ml，置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取照山白药材适量，粉碎，过20目筛，取约0.2 g，置50 ml圆底烧瓶中，精密加入90%乙醇20 ml，称定总重量，加热回流1 h。精密称定，加90%乙醇补足损失量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2 ml，置10 ml量瓶中，加90%乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
精密量取对照品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量（μg）为横坐标，相应峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果在0.05～0.28 μg范围内，金丝桃苷进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y＝8.753 1X－0.015 2，r＝0.999 8。
2.3.2 精密度实验
取照山白药材适量，粉碎，过20目筛，取约0.2 g，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。精密量取20 μl，注入液相色谱仪，重复进样5次，所得峰面积的RSD为0.23%（n=5），表明本方法的精密度较好。 2.3.3 稳定性实验
取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12 h，进样20 μl，记录峰面积，结果峰面积基本不变，RSD为0.39%（n=6），表明供试液至少在12 h内稳定。
2.3.4 重复性实验
精密称取同一批号的样品5份，分别按样品测定项下方法进行测定，取照山白药材细粉，精密称取5份，每份约0.2 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。精密量取20 μl，注入液相色谱仪，按峰面积计算。求得平均含量为0.49%，计算RSD为1.1%（n=5），说明本方法的重复性较好。
2.3.5 回收率实验
取已测定含量的照山白药材适量，粉碎，过20目筛，取约0.1 g（5份），分别精密量取金丝桃苷对照品溶液（精密称取金丝桃苷对照品3.18 mg，置5 ml量瓶中，用90%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀）0.8 ml，依次加入上述5份药材中，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。吸取上述供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积计算。结果见表1。三乙胺时分离效果最佳，系统具有良好的重复性和稳定性。表1 回收率实验结果（略）
2.4 样品含量测定
取3批照山白药材，粉碎，过20目筛，取约0.2 g，精密称定，按2.2.2项下方法，各平行制备5份供试品溶液。精密量取20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果见表2。表2 样品测定结果（略）
b 3.1 流动相的选择
黄酮苷类成分在用HPLC测定时易拖尾，流动相中加入三乙胺可抑制其拖尾［3］。曾使用了低浓度(0.05%，0.1%，0.5%)的醋酸溶液和0.05%磷酸溶液，峰形对称性不好，后用甲醇-0.5%磷酸溶液(44∶56)得到较好的效果。但实验中发现仍有轻微的拖尾现象，经反复实验发现在1 L上述流动相中加入3.7 ml
3.2 检测波长的确定
据报道，金丝桃苷分别在256 nm和360 nm波长处有最大吸收［4］。经紫外扫描和液相色谱测定表明，在360 nm波长处测定干扰较少，且分离效果良好，故选用360 nm作为检测波长。
3.3 提取方法、提取时间及溶剂的选择
本实验曾分别使用超声振荡提取和热乙醇回流提取法，结果证明热乙醇回流法提取效率高；亦就不同提取时间（1，2，3，4 h）和不同乙醇浓度（50%，60%，70%，80%，90%）进行了比较实验，最后确定了提取效率高的90%乙醇回流1h作为供试品溶液的制备方法。
本法简便快速，准确可靠，灵敏度高，可作为照山白中金丝桃苷的含量测定方法，为照山白药材的质量控制提供有效的分析手段。
【参考文献】
［1］宋立人.现代中药学大辞典，第1版［M］.北京：人民卫生出版社， 2001：2274.
［2］杨书斌，谢鸿霞，孙敬勇，等. HPLC法测定山楂中金丝桃苷的含量［J］.中成药，1999，21（9）：475.
［3］沙 明，曹爱民，王 冰，等.高效液相色谱法测定地榆中金丝桃苷的含量［J］.色谱，1998，16（3）：226.
［4］沙 明，曹爱民，杨松松.高效液相色谱法测定朝鲜淫羊藿中金丝桃苷的含量［J］.中国中药杂志，1995，20（6）：357. |
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发表于 2014-8-19 19:59:41
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