芥菜中总黄酮的提取及其对羟自由基的清除作用研究

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【摘要】  目的探讨芥菜中总黄酮的提取、鉴别方法及对羟自由基清除作用，以充分利用芥菜植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从芥菜中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用芥菜总黄酮对羟自由基清除作用进行实验。结果测得样品中总黄酮的含量C=0.4450 mg/ml，回收率为100.7%，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取芥菜中黄酮类物质的有效途径。芥菜总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用。
　　

【关键词】  超声波提取 芥菜 总黄酮 鉴别 自由基 清除

　　Extraction of Total Flavone from Bragica juncea Coss and Its Effects on Scavenging of Hydroxyl Radicals

　　Abstract：ObjectiveTo make use of the resources of Bragica juncea coss， avoid wasting and approach the extraction of total flavanone of Bragica juncea Coss and its effects on scavenging of hydroxyl radicals. MethodsThe flavonoids were extracted by ethanol as the solvent from Bragica juncea coss with ultrasonic wave and ethanol extraction .Using spectrophotometry to extract and check the flavone of Bragica juncea Coss.Results The effect of extracts of Bragica juncea Coss scavenging of hydroxyl radicals was studied．By this method getting the density of the total flavone of Bragica juncea Coss was C=0.4450mg/ml and the rate of recovery was 100.7%. The outcome and the purity of the flavone were all very high . ConclusionThis method is a purely physical process and has not any pollution. It is an ideal way to extract the flavone of Bragica juncea coss. Total flavone from Bragica juncea Coss has effects on scavenging on hydroxyl radicals.

　　Key words：Ultrasonic wave treatment；  Bragica juncea Coss；  Total flavone；  Identification；  Hydroxyl radical；  Scavenging

    芥菜 Bragica juncea Coss又名芥、雪里蕻、皱叶芥、黄芥，为十字花科植物芥菜 Brassia juncea（L.）Czern.et Coss油芥菜Brassia juncea（L.）Czern.et Coss.Var.gracilis Tsen et Lee的嫩茎叶。我国各地均有栽培。春季采嫩叶洗净，民间常用之做腌菜。芥菜性味辛、温。归肺、胃、肾经。具有利气豁痰、温中健脾、驱风散血、消肿止痛等功效。主治寒痰咳嗽、胸膈不利、胃寒少食、腹泻、感冒风寒及跌打损伤、关节疼痛等症 ［1］。目前有研究表明［2］：芥菜中含黄酮苷、酸性树脂、鞣质等，其中黄酮类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和清除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品。

    当前国内外对于芥菜中黄酮类化合物的研究还相对缺乏。目前有用乙醇抽提法提取芥菜中的黄酮类物质的报道［3］，但是，该方法提取的时间较长、工艺较复杂、提取效率较低。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道［4，5］，表明其具有耗能低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［5］，但超声技术应用于提取芥菜中黄酮类物质的研究尚未见报道。本文报道用超声波提取芥菜总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基清除作用。

　　1  仪器与试剂

　　1.1  仪器KQ5200DB型数控超声波清洗器（超声工作频率40 kHz，江苏省昆山市超声仪器有限公司）；UV-755B紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

　　1.2  试剂95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；乙酸镁AR；镁粉AR；正丁醇AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；双氧水AR；硫酸亚铁AR；水杨酸AR；芥菜，采自广西百色市。

　　2  方法与结果

　　2.1  总黄酮成分提取取新鲜芥菜，烘干，粉碎。称取芥菜粉末6 g，加80 ml 95%乙醇，用超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加80 ml 95 %乙醇，用超声波提取2.5 h，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩25 ml为止，放置250 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。

　　2.2  测定方法依据以芦丁为对照品测定芥菜中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。

　　2.3  定量实验-总黄酮的含量测定

　　2.3.1  波长的选择取样品液适量，在0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420～700 nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。

　　2.3.2  标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.10 mg/ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.30    ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白参比液，于510 nm处测吸光度。结果见表1。表1  紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度结果（略）

    根据表1得回归方程：A=-0.0221+13.7578C，r=0.9999。

　　2.3.3  提取物含量的测定精密吸取样品液1.00 ml，置10.00 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测定吸光度,A=0.368，根据回归方程：A=-0.022 1+13.757 8 C，r=0.999 9计算样品中总黄酮的含量C=0.445 0 mg/ml。

　　2.3.4  回收率实验精密量取样品液1.00 ml，加入标准芦丁对照品1.00 ml（0.10 mg/ml），同前样品测定操作方法测定吸光度，求出回收率为100.7% 。　　2.4  定性实验-总黄酮的鉴别

　　2.4.1  颜色反应

    紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。

    浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。

    三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加１％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。

    乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。

    盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1次加入），在泡沫处呈紫红色。

　　2.4.2  纸层析取样品溶液10 μl点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5（体积比）为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。

　　2.5  总黄酮提取物对·OH清除作用参照Fenton反应的方法建立反应体系模型［6］，利用H2O2与Fe2+ 混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。反应式如下：H2O2+ Fe2+ →Fe3++·OH+OH-

    该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+ l ml，9 mmol/L 1 ml水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的芥菜总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在510 nm处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮)对·OH的清除作用，其清除率计算公式：清除率(％)=A0-AxA0×100%

    以实验的提取液作为样品，分别取不同体积的样品定容到10m1分别测其对·OH的清除作用。从图1中可看出，芥菜总黄酮提取液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，随着芥菜总黄酮提取液浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。

　　3  讨论

    实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为100.7%，利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。

    黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［6］。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。

    黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［7，8］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。本实验结果表明，芥菜中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此，有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。



【参考文献】
  　　［1］吴文青，李正军.食用本草［M］.北京：中国医药科技出版社，2003：65.

　　［2］夏杏洲，张 辉，魏传晚.榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究［J］.食品研究与开发,2002,23(5):35.

　　［3］谢丽玲，朱炎坤. 叶芥菜中总黄酮含量测定的研究［J］.仪器仪表与分析监测，2000，3：61.

　　［4］刘祥义.超声波提取元宝枫叶总黄酮方法研究［J］.云南化工，2003，30（1）：27.

　　［5］谢明杰，宋 明，邹翠霞，等.超声波提取大豆异黄酮［J］.大豆科学,2004,23(1):75.

　　［6］李贵荣，杨胜圆．党参多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用［J］．化学世界，2001，42(8)：42l．

　　［7］黄锁义，黎海妮，余美料，等.益母草总黄酮的提取及鉴别［J］.时珍国医国药,2005,16(5):398.

　　［8］黄锁义，阳文辉，李卫彬，等. 超声波提取九里香总黄酮及鉴别［J］. 时珍国医国药，2006，17（3）：395.