绿茶多糖的制备及其含量测定

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【摘要】  目的建立一种稳定、简便的绿茶多糖含量测定方法。方法采用精制绿茶多糖测得绿茶多糖对葡萄糖的换算因子后,样品经除杂处理后,用苯酚－硫酸法测定绿茶中多糖的含量。结果用此方法测定多糖的标准曲线,其相关系数为0.999 7,平均回收率为99.62 % ,相对标准偏差为1.94%。结论该方法所需仪器简单，操作方便,显色稳定，重现性好，适合于绿茶及其制品的多糖含量的常规检测。

【关键词】  绿茶 多糖 提取 苯酚－硫酸法

　　Preparation and Determination of Polysaccharide from Green Tea

　　Abstract:ObjectiveTo develop a stable and simple method to measure the polysaccharide in Green Tea.MethodsAfter the conversion coefficient of polysaccharide from Green Tea to glucose was obtained , the content of polysaccharide was measured by phenol-sulfuric acid method. ResultsThe correlation coefficient of standard curve was 0. 999 7 , the recovery rate was 99.62 % and RSD was 1.94 %. ConclusionThe method is convenient, stable and accurate, which can be used for content determination of polysaccharide from Green Tea as well as it' s related products.

　　Key words:Green Tea;  Polysaccharide;  Extraction;  Phenol-sulturic acid method

    绿茶是历史最早的茶类，又称不发酵茶，以适宜茶树新梢为原料，经杀青、揉捻、干燥等典型工艺过程制成。其干茶色泽和冲泡后的茶汤、叶底以绿色为主调，绿茶也因此得名。最新科学研究结果表明，绿茶中主要化学组成为咖啡因、茶多酚、茶多糖等，咖啡因是一种兴奋剂,具有较好的镇痛作用，咖啡因也是一种和缓的利尿剂,药用上的咖啡因是头痛镇痛的一个组分,它可与麦角胺的酒石酸盐结合起来治疗偏头痛［1］； 茶多酚是一种新型的天然食品抗氧化剂,与抗坏血酸配合时,其抗氧化性能优良，茶多酚也具有高效的抗癌、抗衰老、降血脂等一系列的药理功能［2］；茶多糖具有降血糖、降血脂、降血压及减慢心率、耐缺氧的作用，同时茶多糖在抗凝血、防血栓形成、保护血象和增强人体非特异性免疫功能方面均有明显效果［3］，因此从绿茶中提取的多糖成分在开发降糖新药和功能性食品方面有着广阔的前景。

    绿茶多糖的含量测定对于提取原料的选择及提取工艺的评价具有重要意义。本研究用精制绿茶多糖测得绿茶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经95％乙醇浸泡处理后的绿茶用水提取多糖，采用苯酚－硫酸法测定其含量。现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料核酸蛋白分析仪（DU-640），Beckman公司；电热恒温水槽（DK-8D型），上海森信实验仪器有限公司；台式冷冻离心机（D-78532 Tuttlingen,universal132R）德国；Alphal-2型真空冻干机，德国christ公司；自动收样器，美国Whaters公司等;葡萄糖、苯酚（分析纯重蒸馏试剂）、浓硫酸、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、乙醚、活性炭、聚酰胺吸附树脂等，以上试剂均为分析纯。白沙绿茶（来自于海南白沙农场）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  精制绿茶多糖的制备取干燥绿茶20 g，粉碎，过50目筛，用95％乙醇浸泡1 d后，残渣晒干，热水浸提3次，过滤，合并滤液，加热浓缩至总体积的1/4，将浓缩液离心，上清液中加入三倍体积的95％乙醇沉淀，4℃冷冻过夜，离心，残渣用乙醚－丙酮－无水乙醇溶剂系统反复洗涤，然后将残渣真空低温干燥得到绿茶多糖粗品。绿茶多糖粗品加水溶解，用Sevag法去蛋白［4］，然后将去蛋白多糖溶液上聚酰胺吸附树脂，用蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀为止。将洗脱液浓缩至一定体积，得精制绿茶多糖提取液。精制多糖提取液加入活性碳( 固液比为1∶10)90℃脱色约2 h，趁热过滤，滤液浓缩至一定体积后，再用蒸馏水透析2 d，低温冷冻干燥得精制绿茶多糖。称重，计算得率，备用。

　　1.2.2  6％苯酚溶液配制临用前用80 %苯酚溶液（取重蒸馏苯酚80g加蒸馏水20g溶解，摇匀置棕色瓶，4℃保存）加蒸馏水稀释配制而成。

　　1.2.3  标准葡萄糖溶液的配制精密量取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖1 000 mg,置于1 000 ml量瓶中加水至刻度，配成1 mg/ml的葡萄糖母体溶液，然后稀释20倍，得到要用的50 μg/ml的葡萄糖标准溶液。

　　1.2.4  吸收波长选择精密量取50 μg/ml标准葡萄糖溶液1 ml,置20 ml具塞试管中,依次加入6%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸5.0 ml,静置10  min 后摇匀,室温放置20 min,以蒸馏水同法操作为空白对照，在波长400～600 nm 之间进行扫描,确定最大吸收波长487 nm。

　　1.2.5  标准曲线制备［5］分别精密吸取50 μg/ml标准葡萄糖溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml置具塞的试管中，各以水补至2.0 ml, 依次加入6 %苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸5.0 ml ,静置10 min 后摇匀,室温放置20 min,以2.0 ml蒸馏水同法操作为空白对照,在487 nm波长处测定吸光度，以多糖浓度为横坐标（μg/ml），光密度为纵坐标，绘制曲线，得回归方程为：Y=0.015 4X+0.003 8, r =0.999 7。

　　1.2.6  换算因素确定精密称取干燥至恒重的精制绿茶多糖约5 mg ，置25ml 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得绿茶多糖储备液。精密吸取该溶液2 ml，按“1.2.5”项下的方法测定吸光度，以2.0ml蒸馏水同法操作为空白对照。由回归方程求出此绿茶多糖储备液中葡萄糖浓度，并计算其中葡萄糖含量。按下式计算换算因子：f = W / C ·D 〔W为称取精制绿茶多糖的重量(μg)，C为绿茶多糖储备液中葡萄糖的浓度（μg/ml），D为精制绿茶多糖的稀释倍数〕。　　1.2.7  绿茶样品中多糖含量测定样品溶液制备：取样品绿茶1 g，精密称定，粉碎，过50目筛，用95％乙醇浸泡1 d后，残渣晒干，热水浸提3次，过滤，合并滤液，待冷后转移于1 000 ml容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度作供试品溶液。样品中绿茶多糖含量测定：精密吸取所得样品溶液2.0 ml于具塞试管中，按“1.2.5”项下的方法测定吸光度，由回归方程计算供试液中葡萄糖含量，按下式计算各样品中多糖的含量。多糖含量=C D f/W×100％。式中：C为样品溶液中葡萄糖的含量，D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因子，W为样品重量。

　　1.2.8  稳定性实验精密量取样品溶液2.0 ml，按“1.2.5” 项下的方法测定吸光度，每隔30 min测1次，连续3 h考察其稳定性。

　　1.2.9  重现性实验精密称取同批绿茶样品5份各1 g，按“1.2.7”项下的方法同时制取5份样品溶液。精密吸取样品溶液2.0 ml，分别置于10 ml 具塞刻度试管中，按“1.2.5”项下的方法测定吸光度，计算多糖的含量。

　　1.2.10  回收率实验取绿茶样品6份，每份约0.5 g，精密称定，精密加入精制多糖20 mg，然后按“1.2.7”样品液的制备和“1.2.5”标准曲线项下方法测定吸光度，根据“1.2.9”的结果该批绿茶中多糖的平均含量为3.48%，计算回收率。

　　2  结果

　　2.1  精制绿茶多糖的得率20 g干燥的绿茶按“1.2.1”方法制得精制绿茶多糖0.51 g，得率为2.55%。

　　2.2  换算因子f =1.26。

　　2.3  稳定性实验样品溶液在3 h内显色稳定，结果见表1。RSD=1.31%（n=7）。表1  绿茶多糖含量测定稳定性实验结果（略）

　　2.4  重现性实验以同批绿茶为样品测定多糖的含量，检验此测定方法的重现性，结果见表2。RSD=1.69%(n=5)。

　　2.5  回收率实验精密吸取已知含量的绿茶5份，测定加样回收率，结果见表2。表2  多糖重现性实验（略）

　　3  结论

    苯酚- 硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois 等［6，7］提出的。其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490 nm左右处和一定浓度范围内，其吸光度A 值与糖浓度C呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。本法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。表3  多糖加样回收率实验（略）

    利用精制绿茶多糖测定并计算换算因子，再利用换算因子计算绿茶多糖含量，可有效消除用葡萄糖标准曲线计算多糖含量而带来的误差。加样回收率实验的结果表明，采用此方法测定绿茶多糖含量，平均回收率高达（99.62±1.93）%，RSD=1.94%。

    我国是茶叶生产大国,特别是绿茶占了相当大的比例,但目前中低档绿茶严重滞销，因此，深入开展绿茶多糖的研究有着重大的意义,不仅有利于茶叶资源的充分利用,而且对预防疾病、促进健康都有积极作用，随着绿茶研究的不断深入，从绿茶中提取的多糖有望成为一些疾病的重要治疗药品和功能食品。



【参考文献】
  　　［1］关崇新. 茶叶中咖啡因含量的测定［J］.鞍山师范学院学报,2001,3 (3) :45.

　　［2］Nutr cancer. 绿茶是一种抗氧化剂［J］.国外医学中医中药分册,2001,23 (3) : 191.

　　［3］严鸿德，汪东风，王泽农，等.茶叶深加工技术［M］.北京：中国轻工业出版社，1998：81.

　　［4］齐慧玲，魏绍云，王继伦.等. Sevag 法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000，3：20.

　　［5］张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：上海科学技术出版社,1987：296.

　　［6］Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetricmethod for determination of sugars andrelated substances［J］. Anal Chem,1956,28:350.

　　［7］Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Acolorimetric method for the determination of sugars［J］. Nature,1951,168:167.