肾衰养真胶囊对5/6肾切慢性肾衰竭营养不良大鼠下丘脑信号传导蛋白SOCS3表达

amy54321 · 发表于 2014-8-19 21:45:45

【摘要】  目的探讨细胞因子信号传导抑制剂3（SOCS3）在慢性肾衰竭营养不良大鼠中的表达情况以及肾衰养真胶囊的调节作用。方法 5/6肾切除制作慢性肾衰竭大鼠模型，同时予4%酪蛋白饮食，检测血尿素氮、肌酐、白蛋白、血红蛋白等生化指标和体重，观察其营养不良发生时间，符合条件的随机分为模型组、肾衰养真胶囊治疗组和开同治疗组；另设正常对照组。灌胃4周后应用放射免疫法检测血瘦素水平，免疫组织化学方法检测下丘脑SOCS3蛋白的表达。结果慢性肾衰竭大鼠在术后10周末出现营养不良，肾衰养真胶囊可减低血浆尿素氮、肌酐、瘦素水平，增加白蛋白、血红蛋白水平；与正常组比较，模型组与肾衰养真胶囊治疗组SOCS-3当色阳性信号均强(P<0.001)，但肾衰养真胶囊组SOCS3染色阳性信号显著高于模型组(P<0. 05)。结论肾衰养真胶囊可能部分是通过上调抑制蛋白SOCS3，降低瘦素水平，从而改善慢性肾衰竭大鼠营养不良。

【关键词】  肾衰养真胶囊 5/6肾切除营养不良下丘脑信号传导蛋白

　　Effects of Shenshuai Yangzhen Capsule on SOCS3 in Hapotholums in Malnutrition Rats with Chronic Renal  Failure by 5/6 Nephrectomy

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Shenshuai Yangzhen capsule on SOCS3 in hypothalamus in malnutrition rats with chronic renal failure by 5/6 nephrectomy. MethodsSD rats were received 5/6 nephrectomy for preparation of CRF models, and fed with 4% casein at the same time. The blood parameters, like BUN, SCr, Alb,Hb and weight in CRF rats were determined. We observed when malnutrition began. Those in condition were randomized into CRF control group, ketosteric group, Shenshuai Yangzhen group, and normal control group. After 4-week treatment as indicated, the blood leptin in CRF rats were determined by radioimmunoassay. The protein expressions of  SOCS3 were assessed respectively by immunohestchemistry.ResultsCompared with those in the CRF group, the plasma blood urea nitrogen and serum creatinine concentrations and leptin contents in Shenshuai Yangzhen group were significantly lower with substantially elevated plasma album and haemoglobin. Compared with the normal group rats, the respective expression of SOCS3 significantly increased in rats with surgically induced renal failure (two-stage subetotal nephrectomy) (P<0.001). After treatment with Shenshuai Yangzhen capsule, the expression of SOCS3  in the CRF rats was upregulated (all P<0.05). ConclusionSOCS3 proteins may be involved in the malnutrition associated with CRF. Upregulation of SOCS3 may be responsible for the malnutrition effects of Shenshuai Yangzhen capsule in CRF rats.

　　Key words:Shenshuai Yangzhen capsule;  5/6 nephrectomy;  Hapotholums;  Immunohestchemistry; Signal transducer protein

动物实验表明瘦素（Leptin）在下丘脑的信号传导主要涉及JAK2/STAT3通路。OBR配体与OBRb受体结合使OBRb细胞内的酪氨酸残基磷酸化，并通过转磷酸作用活化JAK2。磷酸化的OBRb形成了一个与STAT3（信号传导转录活化因子Signal transducer and activator of  transcription，STAT）单体连接的位点，STAT3一旦到达受体在C端的705位点被JAK2磷酸化，使STAT3形成同型或异型二聚体，并转移定位到细胞核，与特定基因启动子区域的DNA元件或其他的转录因子或附属的蛋白相互作用，调节靶基因的转录。Leptin在活化JAK2/STAT3信号传导途径的同时，也促进相关抑制剂的表达，包括细胞因子信号传导抑制剂（Suppressor of cytokine signaling，SOCS）。在转染了SOCS3基因的COS细胞，当Leptin存在时SOCS3可与JAK2结合，并抑制Leptin诱导的JAK2的各氨酸磷酸化，提示SOCS3通过与JAK2结合而抑制了JAK2的各氨酸激酶活性，从而抑制了OBR后的JAK/STAT信号传导通路。5/6肾切除可造成典型的慢性肾衰竭，本实验观察了肾衰养真胶囊对5/6肾切慢性肾衰竭营养不良模型大鼠下丘脑信号传导蛋白SOCS3表达的影响，从分子水平探讨肾衰养真胶囊如何通过对SOCS3蛋白的调节作用而发挥改善营养不良的作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

　　健康♂SD大鼠(两月龄)，180～220 g，SPF级，动物合格证号：粤检动字2005A047，由第一军医大学实验动物中心提供。

　　1.2  药物制备

　　肾衰养真胶囊由人参、黄芪、当归等药物组成，广东省药材公司提供，本校中药教研室鉴定。本校中药新药实验室按处方比例提取制剂，制成胶囊，每克成药含生药5.67 g。成人用量成药15 g/d,换算为大鼠剂量生药量8 g·kg-1·d-1。

　　1.3  造模给药与标本收集

　　动物购入7 d后，预留8只为正常对照组，参照文献［1］采用二步法5/6肾切除制作慢性肾衰竭营养不良模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，皮肤消毒后切开大鼠左腹壁，暴露左肾，切开上、下两极的包膜，呈放射状切除左肾上、下两极，切除约70%，迅速用明胶海绵轻压在残留肾的创面后，依次缝合关腹。10 d后经右腹壁暴露右肾，血管钳夹住血管，结扎，摘除右肾。

每2周末从正常组和造模组大鼠随机抽取5只尾静脉采血，留取血清采用南京建成公司试剂盒检测尿素氮、肌酐、白蛋白、血红蛋白含量，称大鼠体重。动态观察CRF大鼠营养不良情况，符合营养不良模型条件的大鼠随机分为3组，即模型（CC组）组、肾衰养真胶囊治疗组(SSYZ组)和开同治疗组（KT组）。正常（MC组）组不施加任何影响，模型组予蒸馏水灌胃, 肾衰养真胶囊治疗组和开同治疗组分别给予肾衰养真胶囊、开同灌胃4周。所有大鼠在整个实验期间均自由进水，正常组喂标准饮食，造模组2次术后予4%酪蛋白喂养。

治疗结束后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，预留2 ml以肝素抗凝，其余分离血清，测定BUN，血Scr，Alb含量；参照大鼠神经解剖图谱，由有经验的技术人员取材，取出腹膜后脂肪及矢状面第3脑室上缘1 mm和乳头体前上部的下丘脑组织，急送－70℃液氮保存待测。

　　1.4  观察指标与方法

　　1.4.1 一般情况

　　主要观察精神状态、活动度、毛发光泽度、饮食、体重、死亡率等。　

　　1.4.2  血生化检测

　　采用二乙酰一肟法检测尿素氮、苦味酸法检测肌酐及溴甲酚绿比色法检测白蛋白；血红蛋白检测应用氰化高铁血红蛋白比色法检测，用紫外分光光度计检测吸光度换算结果。

　　1.4.3  血浆Leptin的测定

　　采用放射免疫法测定（试剂盒为解放军总医院科技开发中心），用软件绘制标准曲线并计算出Leptin含量。

　　1.4.4  免疫组织化学方法检测信号传导蛋白SOCS3在下丘脑的表达选取弓状核、腹内侧核等所在部位的切片，采用免疫组织化学的SP法［2］，具体如下：(1)石蜡切片和水化后，用PBS(pH=7.4)冲洗3次，5 min/次。(2)每张切片加5 μl过氧化物酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。(3)PBS冲洗3次，5 min/次。(4)每张切片加5μl非免疫性动物血清，室温下孵育5 min，PBS冲洗1次。(5)每张切片加5μl的第一抗体，室温下孵育60 min。(6)PBS冲洗3次，5 min/次。(7)每张切片加5 μl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min；酶溶液，室温下孵育10 min。(8)PBS冲洗3次，5 min/次。(9)每张切片加5 μl HRP溶液，显微镜下观察10 min。(10)自来水冲洗，苏木素染色，中性树胶固定。一抗为SOCS3羊抗鼠的多克隆抗体，SantaCruz公司产品；稀释度为1∶400。二抗分别为兔抗羊IgG生物素标记试剂，稀释度为1∶1 000，购于武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司，PBS代替Ⅰ抗作阴性对照, DAB（联苯二胺）显色。盲法观察，采用半定量分析，随即选取20个连续不重复的视野（×400），根据阳性着色的范围分为5级，阴性计0分，微量着色计0.5分，轻度着色计1分，中度着色计2分，广泛着色计3分。取平均数作为每张切片的阳性数。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS10.0统计软件，计量资料用±s表示，前后比较用配对t检验，多组间比较采用方差分析。
　　2.4  肾衰养真胶囊给药前后血红蛋白变化给药前各造模组之间血红蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)，与正常对照组比较显著降低(P<0.001)；给药后肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组与模型组相比血红蛋白值显著升高 (P<0.001)，肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组之间无显著差异(P＞0.05)。结果见表1。表1  各组给药前后白蛋白、血红蛋白的比较(略)

　　2.5  肾衰养真胶囊给药后血浆Leptin含量变化

　　给药后模型组、开同治疗组与正常组相比血浆Leptin含量有显著性差异(P<0.001)，给药后肾衰养真胶囊治疗组与模型组相比血浆Leptin含量有显著差异 (P<0.01)，肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组之间有显著差异(P<0.01)。结果见表2。表2  各组给药后瘦素的比较(略)

　　2.6  肾衰养真胶囊对下丘脑SOCS3表达的影响

　　实验大鼠下丘脑SOCS3表达水平比较　实验大鼠下丘脑SOCS3阳性染色为棕黄色，以胞浆为主，神经元轴突，树突亦有；阴性对照无SOCS3阳性染色。与正常组比较，CC组及SSYZ组SOCS3阳性信号强，(P<0.001)；但SSYZ组SOCS3染色阳性信号显著高于模型组(P<0.05)。KT组下丘脑SOCS3，PIAS3染色阳性信号介于模型组与正常组之间，比正常组多，比模型组少。SSYZ组与KT组相比，SOCS3染色阳性信号有显著差异(P<0.001)。结果见表3。表3  各组给药后SOCS3在下丘脑的染色阳性信号结果(略)

　　3  讨论

慢性肾衰竭(Chronic Renal Faliure， CRF)患者存在明显的营养不良［3］，蛋白质-能量营养不良是CRF重要的并发症之一，并可进一步导致免疫功能低下及贫血等，甚至引起多脏器功能衰竭，其发生不仅影响CRF患者的生活质量，亦是影响CRF患者生存率的主要因素之一［4～8］。慢性肾衰竭营养不良病因及发病机制十分复杂［9，10］，目前尚不清楚。Leptin是新近发现的具有调节食物摄入和能量代谢的激素样蛋白，主要生理功能是感受机体的营养状况，通过调节食物摄入和能量代谢来调节体重，其与许多疾病关系密切。瘦素主要通过肾脏排泄，研究发现许多CRF患者均合并高瘦素血症［11］，研究亦发现CRF透析患者血Leptin与体脂含量之比与患者蛋白质摄入量呈显著负相关，与血清白蛋白、转铁蛋白呈负相关，与蛋白质分解率呈负相关。Leptin进入血循环后，通过位于脉络丛的Ob-R转运至脑脊液中，在下丘脑瘦素与其长型受体结合，作用于JAK2/STAT3通路，使STAT3活化，并转移定位到细胞核，与特定基因启动子区域的DNA元件或其他的转录因子或附属的蛋白相互作用，调节靶基因的转录，使食欲下降，食物的摄入减少。CRF时，高Leptin血症引起食欲低下可能是导致营养不良的重要因素。Leptin在活化JAK2/STAT3信号传导途径的同时，也促进相关抑制剂的表达，对Leptin及信号传导通路中SOCS3蛋白与慢性肾衰竭营养不良关系的深入研究，进一步探讨慢性肾衰竭营养不良发生的分子机制，有可能为治疗慢性肾衰竭营养不良提供新的契机。

SOCS3是JAK2/STAT3中的一个重要抑制蛋白［12］。由瘦素专一诱导产生，转而阻断瘦素的JAK2/STAT3信号传导通路。Karen和Bjorbaek等发现Leptin可以刺激信号传导相关蛋白SOCS3在中枢的表达，给予ob/ob鼠外源性的Leptin，在下丘脑可以快速地诱导SOCS3mRNA表达的增加。在下丘脑表达高水平的Ob-R的区域, SOCS3mRNA的增加是Leptin剂量依赖的。 Bjorbaek等也发现Leptin抵抗的Aya肥胖小鼠，其下丘脑弓状核和背内侧核中SOCS3ｍRNA水平明显升高。外周给予ob/ob小鼠或正常Wistar大鼠重组Leptin后，可迅速诱导下丘脑中SOCS3ｍRNA的表达，对CIS，SOCS1及SOCS2等其他SOCS家族成员的表达则无影响，说明虽然多种细胞因子可以同时诱导多种SOCS家族成员的表达，但Leptin专一地诱导SOCS3基因的表达。瘦素引起的SOCS3水平升高反馈抑制瘦素信号传导途径中的JAK2酪氨酸磷酸化和JAK诱导的瘦素受体的酪氨酸磷酸化而阻断瘦素信号产生瘦素抵抗。

CRF属于中医的“关格”“癃闭”“水肿”“虚劳”等范畴。临床研究发现CRF营养不良表现为面色萎黄，神疲乏力，纳差，消瘦，舌质淡，苔厚腻等。其起病缓慢，病史较长，病情迁延，较为复杂。其发病机制为脾肾衰败，气血亏虚，湿浊中阻。其中最为关键的是脾。脾主运化水谷精微、化生气血，若脾气衰败，运化无力，不能化生气血，则可导致气血虚损。故有“脾为后天之本，气血生化之源”之说。脾的运化也包括胃主受纳的功能，虽然人体有病，但若能维持正常的饮食，则可依靠人体的正气抗邪，即所谓“有胃气则生，无胃气则死”。这与CRF不能进食所需要的营养，出现营养不良，最后导致多脏器衰竭死亡是一致的。中医药治疗CRF营养不良有个别报道，大多采用健脾益气的方法，有一定的疗效，但大部分局限于临床观察，缺乏深入的机理研究。

中药复方肾衰养真胶囊由人参、黄芪、当归等组成, 具有益气养血泻浊的作用。是导师魏连波教授根据中医理论和多年的临床经验总结出的治疗CRF营养不良的协定方，临床研究与动物实验均证实该药可纠正蛋白质代谢紊乱，改善食欲，改善蛋白质营养不良［13，14］。本实验运用5/6肾切除制作大鼠CRF，同时予4%酪蛋白喂养，动态检测血浆白蛋白、血红蛋白，称取体重等，待造模组体重与正常对照组相比下降20%，即作为慢性肾衰竭营养不良的动物模型，十分切中临床。本实验结果显示，与正常对照组相比，模型组和治疗组大鼠体重、白蛋白、血红蛋白水平均显著降低，而且随时间延长降低更加明显。在术后10周末，造模组大鼠符合营养不良条件。以往实验证实，肾衰养真胶囊可以提高CRF大鼠血清总蛋白和白蛋白水平，改善其营养不良。由于CRF普遍存在高Leptin血症，研究发现CRF营养不良与Leptin关系密切，我们设想中药肾衰养真胶囊是否可以通过上调SOCS3表达，降低Leptin水平，从而进一步改善食欲，提高血清白蛋白、血红蛋白水平而改善营养不良。本实验发现，肾衰养真胶囊治疗组SOCS3表达水平较模型组上调，肾衰养真胶囊治疗组血浆Leptin水平较模型组降低，肾衰养真胶囊治疗组血浆白蛋白、血红蛋白较模型组升高，说明肾衰养真胶囊可能通过上调SOCS3表达，降低Leptin水平，进一步提高血清白蛋白、血红蛋白水平而改善营养不良，与实验设想一致。

需要说明的是，实验中，我们仅观察了药物治疗4周时对CRF营养不良大鼠的影响，而肾衰养真胶囊对CRF营养不良的长期作用，SOCS3与营养不良的具体机制，尚需进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］施新猷.现代医学实验动物学，第1版［M］.北京：人民军医出版社，2000：476.

　　［2］任占平,郑绍光,陈尉麟.应用SP免疫组化染色法的体会［J］.诊断病理学杂志,1994,1(3)：176.

　　［3］林善锬.重视慢性肾脏疾病患者营养问题的研究［J］.上海医学,2002,25(11)：669.

　　［4］Leavey SF, Strawderman RL, Jones CA, et al. Simple nutritional indicators as independent predictors of mortality in hemodialysis patients［J］. Am J Kidney Dis, 1998,31(6)：997.

　　［5］Stenvinkel P, Barany P, Chung SH, et al. A comparative analysis of nutritional parameters as predictors of outcome in male and female ESRD patients. Nephrol［J］. Dial. Transplant, 2002, 17：1266.

　　［6］Qureshi AR, Alvestrand A, Divino-Filho JC, et al. Inflammation, Malnutrition, and Cardiac Disease as Predictors of Mortality in Hemodialysis Patients［J］. J Am Soc Nephrol, 2002,13：28.

　　［7］Pifer TB, McCullough KP, Port FK, et al. Mortality risk in hemodialysis patients and changes in nutritional indicators：DOPPS［J］.Kidney Int, 2002, 62(6)：2238.

　　［8］Lowrie EG, Lew NL. Death risk in hemodialysis patients: the predictive value of commonly measured variables and an evaluation of death rate differences between facilities［J］.Am J Kidney Dis, 1990,15(5)：458.

　　［9］董捷,范敏华,齐惠敏,等.腹膜透析患者营养不良和蛋白质能量摄入不足的临床影响因素分析［J］.中华医学杂志，2002,82(1)：61.

　　［10］Mitch WE and Maroni BJ. Factors causing malnutrition in patients with chronic uremia［J］.Am J Kidney Dis, 1999，33(1)：176.

　　［11］韦洮,王文革,王永泰.瘦素与慢性肾功能衰竭［J］.国外医学泌尿系统分册,2000,20(1):8.

　　［12］Crouse J A, Elliott G E, Burgess T L, et al. Altered Cell Surface Expression and Signaling of Leptin Receptors Containing the fatty Mutation［J］. J. Biol. Chem, 1998; 273: 18365.

　　［13］马志刚,魏连波,黄琳,等.肾切除慢性肾衰竭大鼠营养不良与慢性炎症状态以及肾衰养真胶囊的干预试验［J］.陕西中医,2004,25(8)：762.

　　［14］黄琳,魏连波,耿穗娜,等.肾衰养真胶囊对慢性肾衰竭大鼠蛋白质营养不良及ALB、IGF-1基因表达的影响［J］.四川中医,2004,22(8)：13.
　　2  结果

　　2.1 一般情况　

　　正常对照组大鼠表现机警，反应快，皮毛致密，整齐而有光泽，饮食正常，体重逐渐增加；造模组大鼠精神萎靡，活动迟缓，皮毛蓬松，枯槁无光泽，甚至弓背蜷体，食欲减退，体重增加缓慢。经5/6肾切除术后10周末，共死亡7只；符合肾衰营养不良大鼠模型，随机分为模型组、肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组，给药灌胃4周，每组各死亡2只。

　　2.2  CRF营养不良模型

　　灌胃前大鼠检测血清Scr结果为（108.62±19.51）μmol·L-1，BUN结果为（21.94±4.21）mmol·L-1，白蛋白（31.36±3.29）g·L-1，血红蛋白(94.41±2.48) g·L-1，体重（378.89±44.68）g，27只符合肾衰合并营养不良的条件。

　　2.3  肾衰养真胶囊给药前后白蛋白变化

　　给药前各造模组之间白蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)，与正常对照组比较显著降低(P<0.01)；给药后肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组与模型组相比白蛋白值显著升高 (P<0.01)，肾衰养真胶囊治疗组、开同治疗组之间无显著差异(P＞0.05)，正常组无变化。结果见表1。

		自动登录	找回密码
密码			立即注册

[药学] 肾衰养真胶囊对5/6肾切慢性肾衰竭营养不良大鼠下丘脑信号传导蛋白SOCS3表达