叶下珠有效部位总提取物致突变实验研究

amy54321

【摘要】  目的评价叶下珠有效部位总提取物的致突变性。方法采用微核实验、Ames实验和体外染色体畸变实验对叶下珠有效部位总提取物进行了诱变性检测。结果小鼠体内骨髓细胞微核实验未发现骨髓细胞微核率增加， Ames实验中对TA97，TA98，TA100，TA102 4种菌株加与不加S9均未发现回变菌落数增加，体外染色体畸变实验加与不加S9均未发现染色体畸变率超过5%。3个实验结果均为阴性。结论在该实验条件下，未检出叶下珠有效部位总提取物的诱变性。

【关键词】  叶下珠有效部位总提取物 诱变 微核实验小鼠体内骨髓细胞微核实验 Ames实验 体外染色体畸变实验

　　Study on Mutagenicity of Total Extracts of Yexiazhu(TEY)

　　Abstract：ObjectiveTo evaluate the mutagenicity of total extracts of Yexiazhu(TEY). MethodsThe micronucleus test in mice, Ames test and chromosome aberration test were carried out.ResultsThe micronucleus rates in all doses were not significantly different from the control group. No increase in the number of revertant colonies was found in the Ames test with and without S9 activation system. Negative results were seen from chromosome aberration test in CHL cell. ConclusionNo mutagenicity effects of TEY were detected in this study .

　　Key words：Total extracts of Yexiazhu；  Mutagenicity;  Micronucleus test in mice;  Ames test;  Chromosome aberration test

    叶下珠有效部位总提取物的一般药理学研究，大鼠长期毒性实验均未发现对机体的毒性作用，Beagle犬长期毒性实验中表现出大剂量可逆转性毒性［1，2］，为确保叶下珠有效部位总提取物临床用药的安全性，对其作出可靠的毒理学评价，笔者采用小鼠体内骨髓细胞微核实验、Ames实验和体外染色体实验研究本品的诱变性。

　　1  材料

　　1.1  受试药物叶下珠有效部位总提取物,四川省中药研究所提供。批号：930701。用蒸馏水溶解并配制成不同浓度的受试物液。

　　1.2  阳性对照物环磷酰胺(CP),上海华联制药公司产品；3-硝基9-芴酮（2.4.7-TNFone）-Fluka AG产品；丝裂霉素C（MMC）-Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd.产品；2-氨基芴（2-AF）-Aldrich产品。

　　1.3  动物昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重20～24g，由四川省抗生素研究所提供（合格证号：川实动管第92号）。

　　1.4  菌株TA97，TA98，TA100，TA102 4种鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株，由四川省卫生防疫站提供，鉴定符合要求后进行实验。

　　1.5  细胞系CHL细胞系由重庆市计划生育科学研究所提供，鉴定符合要求后进行实验。

　　1.6  代谢活化剂S9自制（Aroclor1254诱导），经鉴定符合要求，于-80℃低温冰箱保存。

　　2  方法［3～5］

　　2.1  小鼠体内骨髓细胞微核实验3个叶下珠有效部位总提取物给药组的剂量分别为：356，1 067和3 200 mg/kg，一个阴性对照组（蒸馏水）和阳性对照组（环磷酰胺 50 mg/kg）。各组均按2 %容积灌胃，1次/d，共4 d。最后1次灌胃后24 h处死小鼠，取胸骨骨髓涂片，固定后10 % Giemsa液染色，采用双盲法油镜下每只动物观察1 000个嗜多染红细胞（PCE），记录含微核的细胞数。计算微核率（‰），用χ2检验分析各受试组与阴性对照组微核率的差异性。同时观察并计算PCE/NCE（正染红细胞）的比值。

　　2.2  鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验以TA97，TA98，TA100，TA102 4种鼠伤寒沙门氏突变菌株进行加S9 与不加S9的标准平板掺入法。叶下珠有效部位总提取物用蒸馏水溶解，设5000，500，50，5 ，0.5 μg/皿5个剂量组，阳性药3-硝基9-芴酮（每皿0.5 μg，-S9）、MMC（每皿0.5 μg，-S9）、2-AF（每皿20 μg，+S9）。每一剂量均做3个平行皿，试验重复1次。于每皿加底层培养基20～25 ml，待凝固后，在平皿上做好标记。取融化并保温在45℃的上层培养基一管（3 ml），依次加入菌液0.1 ml，受检物0.1 ml，需S9时，加S9混合物0.5 ml，充分混匀，然后铺倒在底层培养基上，并充分混匀，待上层凝固后，将平板翻转置37℃培养48 h后观察结果。统计方法：使用《中国医学百科全书 医学统计学》统计软件包（第2版），对结果进行方差分析，q检验。

　　2.3  CHL细胞染色体畸变实验

　　2.3.1  0%生长抑制浓度（IC50）的测定采用台盼蓝染色法计数活细胞数，计算细胞相对存活率。细胞相对存活率(%)=（剂量组活细胞数/阴性对照组活细胞数）×100%。当相对存活率为50%时，所对应的剂量即为IC50。　　2.3.2  实验步骤以CHL细胞进行加与不加S9的染色体畸变试验法。叶下珠有效部位总提取物样品用超纯水溶解并配制成不同浓度的受试物液，设100.00，50.00，25.00，12.50μg/ml和6.25 μg/ml 5个剂量组，同时设空白对照和阳性对照。阳性药为MMC（0.50 μg/ml，作用24 h，-S9；0.25 μg/ml，作用48 h，-S9）及CP（50.00 μg/ml，±S9），每一剂量组均作两个平行样，实验重复1次。不加S9时，每个培养瓶加入含10%新生小牛血清的 Eagle's MEM 培养液4.9 ml，受试物溶液0.1 ml；加S9时，每个培养瓶加入含10%新生小牛血清的Eagle's MEM 培养液4.5ml，受试物溶液0.1ml，同时加入S9混合物0.4ml，充分混匀。不加S9的试验加受试物后24，48 h分两批收获细胞；加S9的试验加受试物培养6 h后，弃培养液，换不含受试物的新鲜培养液继续培养至24 h收获细胞。常规用双盲法进行染色体畸形分析，每次实验每个剂量组至少观察100个中期分裂相。

　　3  结果

　　3.1  小鼠体内骨髓细胞微核实验见表1。阴性与阳性对照组的微核细胞率与文献报道相符，说明本实验系统可靠。3个剂量组与阴性对照组的微核细胞率比较均无显著性差异(P>0.05)，且各剂量组的PCE/NCE的比值显示本品对小鼠骨髓细胞无抑制毒性。结果表明，受试物叶下珠有效部位总提取物对小鼠骨髓细胞微核实验中，未见小鼠骨髓细胞微核出现率增加，为阴性结果。表1  叶下珠有效部位总提取物（简称叶下珠）对小鼠骨髓细胞微核实验结果（略）

　　3.2  鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验如表2。结果表明叶下珠有效部位总提取物各剂量组在加与不加S9条件下其每皿回变菌落数均未超过溶剂对照组的两倍，也不存在剂量反应关系。两次实验结果经统计学分析，无显著性差异，叶下珠有效部位总提取物对鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验结果为阴性。表2  叶下珠有效部位总提取物（简称叶下珠）诱发鼠伤寒沙门氏菌回变结果（略）

　　3.3  CHL细胞染色体畸变实验见表3～4。结果表明叶下珠有效部位总提取物对CHL细胞的50%生长抑制 。表3  IC50测定结果（略）表4  叶下珠有效部位总提取物(简称叶下珠)CHL细胞染色体畸变分析结果（略）

    浓度约为100 μg/ml，各剂量组在加与不加S9条件下其诱导CHL细胞染色体畸变率均未超过5%。叶下珠有效部位总提取物对CHL细胞染色体诱发畸变结果为阴性。

　　4  讨论

    叶下珠有效部位总提取物3个剂量组与阴性对照组的微核细胞率比较均无显著性差异(P>0.05)，且各剂量组的PCE/NCE的比值显示本品对小鼠骨髓细胞无抑制毒性，表明叶下珠有效部位总提取物对小鼠骨髓细胞微核无影响。叶下珠有效部位总提取物各剂量组在加与不加S9条件下其每皿回变菌落数均未超过溶剂对照组的两倍，也不存在剂量反应关系。两次实验结果经统计学分析，无显著性差异。在本实验条件下，叶下珠有效部位总提取物对鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验结果为阴性。叶下珠有效部位总提取物对CHL细胞的50%生长抑制浓度约为100 μg/ml，各剂量组在加与不加S9条件下其诱导CHL细胞染色体畸变率均未超过5%。叶下珠有效部位总提取物对CHL细胞染色体诱发畸变结果为阴性。综上所述，叶下珠有效部位总提取物对小鼠体内骨髓细胞微核实验、Ames实验和体外染色体畸变实验的结果均为阴性，在本实验条件下，未发现叶下珠有效部位总提取物的诱变性。

【参考文献】
  　　［1］温志坚，周永禄，曹 毓.叶下珠有效部位总提取物一般药理作用研究［J］.时珍国医国药，2007，18（5）：1120.

　　［2］温志坚，彭龙玲，杨亚斯. 叶下珠有效部位总提取物对大鼠长期毒性实验［J］.时珍国医国药，2007，18（4）：853.

　　［3］中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南［S］. 1994：216.

　　［4］Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicitytest［J］. Mut Res，1983，113：173.

　　［5］胡渝华，刘玉清，张晓玲，等.萘丁美酮的诱变性和致癌性研究［J］. 华西医科大学学报，1997，28（2）：174.