超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研究

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【摘要】  的研究甘草中的黄酮提取方法和抗菌活性。方法利用超声波技术通过正交试验提取甘草中的黄酮，杯碟法对其进行抗菌活性的研究。结果超声波最佳的提取条件为功率385W，80%乙醇，料液比为1∶15，提取时间为8 min，黄酮提取率为6.23%。该提取液对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉都有明显的抑菌效果，最低抑菌浓度分别为：0.062 5,0.062 5,0.031 3,0.15,0.25 mg/ml；最小杀菌浓度为0.25,0.125,0.031 3,0.5,0.25 mg/ml。结论超声波技术是提取甘草黄酮的高效方法，甘草具有较强的抗菌活性。
目

【关键词】  超声波提取 甘草 黄酮 抑菌活性

　　Studies on Flavonoids Extraction by Ultrasonic Technology from Glycyrrhiza and their Bacteriostatic Activity

　　Abstract:ObjectiveTo study on flavonoids extraction from Glycyrrhiza and their bacteriostatic activity. Methods Using ultrasonic technology, flavonoids were extracted form Glycyrrhiza by orthogonal experiment, and their bacteriostatic activity were studied by cylinder plate method. Results The optimum extractive conditions for flavonoids were ultrasonic power 385W, ethanol 80%, ratio of solid to liquid 1∶15, extracting time 8 min. Ultrasonic technology had the highest extraction rate 6.23%. The substance extracted showed some antibiotic activity against Staphylococcus aureus, Bacillus subtil, Escherichia coli, Aspergillus niger, penicillium, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.0625, 0.0625, 0.0313, 0.125, 0.25 mg/ml, and minimum bactericidal concentrations (MBC) was 0.25, 0.125, 0.0313, 0.25, 0.5 mg/ml respectively.Conclusion Ultrasonic technology is an effective method for extracting flavonoids from Glycyrrhiza, which showed strong antibiotic activity.

　　Key words:Ultrasonic extraction；  Glycyrrhiza；  Flavonoids；  Bacteriostatic activity

    甘草是豆科甘草属植物干燥的根和根茎，是临床上最常用的中药材之一［1］。近年来，对甘草黄酮化合物的研究引起了人们的关注。据报道，甘草黄酮是一类生物活性较强的天然产物，具有抗菌、抗氧化、抗心率失常、抗肿瘤、降血脂、保肝等作用［2，3］，超声波具有加速药材中有效成分溶解、缩短提取时间、提高有效成分的提取率等优点［4］，因此，本文通过正交实验探讨超声波提取甘草黄酮的最佳提取条件，为大规模高效生产甘草黄酮提供了有力的理论依据。甘草黄酮的体外抗菌的研究较少，本实验对最佳提取条件下的黄酮提取液对一些细菌和真菌进行了抑菌试验，旨在能开发一种天然的抑菌剂，并为临床用药提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料甘草：购于湖南长沙康尔佳药店，粉碎过40目筛，80℃烘干备用。

    芦丁标准品：购于中国上海医药化学试剂公司

    供试菌种：金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉由本实验室保存并培养。

　　1.2   方法

　　1.2.1  超声波提取法称取甘草粉10 g，采用L9（34）按表1方法进行超声波提取，提取液过滤，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。

　　1.2.2  对比实验

    煎煮法：称取甘草粉10g，加水200 ml，浸泡30 min，煮沸后，文火煎60 min，过滤，共煎煮两次，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。

    连续回流提取法：称取甘草粉10 g，加80%乙醇200 ml，水浴回流80 min，过滤，共提取两次，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。表1  因素水平表（略）

　　1.2.3  标准曲线的制作称取在105℃下干燥恒重的芦丁对照品10 mg，用95%的乙醇溶解，摇匀，定容至10 ml使之成为浓度为1 mg/ml的芦丁标准品溶液，作为储备液备用。

    量取上述溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，分别加水至3 ml，加5%的亚硝酸钠溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.5 ml，摇匀，放置6 min，后加5%的氢氧化钠溶液2.5 ml，混匀，放置15 min后蒸馏水定容10 ml，用紫外分光光度计在510 nm处测其吸光度，得到回归方程为：A＝9.933 9C－0.001 73（R2=0.997 5）

　　1.2.4  甘草黄酮的抑菌实验采用杯碟法测定其抑菌作用，取浓度106～107CFU/ml的各种待试菌悬液0.2 ml，与相应灭菌培养基15 ml混合制成混菌平板，凝固后，在平板上等距离放入4个灭菌牛津杯，每个菌设置3个重复，一个无菌生理盐水为对照，取0.1 ml黄酮提取液加入牛津杯中，细菌37℃、真菌28℃培养18～24 h后，移去牛津杯，量取抑菌圈直径，直径越大抗菌活性越强。

　　1.2.5  最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定用无菌水将甘草黄酮提取液稀释，终浓度分别为1，0.5，0.25，0.062 5，0.031 3，0.007 8 mg/ml。取2 ml提取稀释液至15 ml培养基，混匀后，倒入平板，凝固后加入100 μl 106～107CFU/ml的菌液，涂布均匀，放至37℃/28℃培养24 h后观察结果。菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度即MIC。培养48 h后，菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度为MBC。　2  结果与分析

　　2.1  超声波提取法条件的优化利用L9（34）正交试验法优化甘草黄酮提取条件结果见表2，各因素对试验结果影响顺序为A>C>D>B，即超声波功率对黄酮提取率的影响效果最为显著，其次是超声波时间。最佳提取条件为A3B2C2D1，即在功率为385W，80%乙醇，料液比为1∶15，提取时间为8 min条件下甘草提取液黄酮含量最高。以该最佳提取条件进行验证实验，甘草黄酮提取率为6.23%，RSD＝0.862%（n＝6），因此该最佳提取条件是可行的。表2  正交实验结果（略）

　　2.2  提取方法的比较由表3可知，超声波提取方法的提取率明显高于其它两种方法，且提取时间最短，提取溶剂用量最少。表3  不同的提取方法与黄酮含量的关系（略）

　　2.3  抑菌圈的确定由表4可以看出甘草黄酮提取液对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉都有较强的抑菌效果。而且对细菌的抑制效果强于真菌。表4  黄酮提取液的抑菌效果（略）

　　2.4  最低抑菌浓度和最小杀菌浓度的确定结果见表5。表5  甘草黄酮最低抑菌浓度和最小杀菌浓度（略）

    由表5可知，甘草黄酮对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉的最低抑菌浓度分别为0.062 5，0.062 5，0.031 3，0.125，0. 25 mg/ml；最小杀菌浓度为0.25，0.125，0.031 3，0.5，0.25 mg/ml。

　　3  讨论

    对于甘草黄酮的提取方法的研究已有一些报道，如煎煮法、连续回流法、浸渍法、酶解法、微波提取法和超声波提取法等，其主要是以超声波提取法的效率最高［5，6］，这与本实验结果相一致，这是由于超声波振动空化、机械粉碎、搅拌等作用，使植物组织中的细胞破裂，利于溶剂渗透到植物细胞内部，使细胞中的成分进入溶剂中，加速相互渗透，增加了黄酮在溶剂中的溶解，且其破碎过程是一个物理过程，黄酮化合物的生物活性在一定时间内保持不变。与其它实验结果比较，本实验的甘草黄酮提取率更高，达6.23%。

    黄酮类化合物是药用植物的一大类有效成分，具有多种生物活性，主要的作用之一是抑菌或杀菌［7］。目前，甘草黄酮对真菌的研究还未见报道，本实验结果表明，甘草黄酮对真菌有一定的抑制作用，是一种天然的抑菌剂，可望用于食品保藏，抗菌消炎等，为甘草的综合利用开辟新的途径。



【参考文献】
  　　［1］金 宏.浅谈甘草药理作用［J］.时珍国医国药,2000,11(1)：78.

　　［2］季宇彬，姜 薇，范玉玲,等.甘草黄酮的研究进展［J］.中草药,2004,35(9)：52.

　　［3］聂小华，尹光耀，史宝军，等.甘草有效成分体外抗肿瘤活性和免疫活性的研究［J］.中药材，2003,26(7)：5082.

　　［4］赵 茜,李秉滔,刘 欣,等. 超声强化甘草酸提取的研究［J］.食品科技，2000 (5)：38.

　　［5］汪河滨,李炳奇,李学禹,等.甘草中黄酮的超声波提取及含量测定［J］.时珍国医国药，2004,15(12)：815.

　　［6］崔永明,余龙江,敖明章,等.甘草总黄酮提取技术及其抑菌活性研究［J］.中药材，2006,29(8)：838.

　　［7］俞佩芳. 三种常见药用植物抗菌作用的探讨［J］.华东师范大学学报(自然科学版)，1994(1)：89.