川芎嗪对癫痫的作用及其与神经递质关系的研究

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【摘要】  目的研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对癫痫的作用及其与神经递质谷氨酸（glutamate ,Glu）、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric ,GABA)的关系。方法采用腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazol ,PTZ) 诱发大鼠癫痫模型。将SD大鼠随机分为3组，即：生理盐水对照组；戊四氮致痫组；川芎嗪+戊四氮致痫组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠大脑皮层、海马谷氨酸、γ-氨基丁酸阳性神经元的表达变化。结果戊四氮致痫组与对照组比，大脑皮层、海马Glu阳性神经元明显增多，大脑皮层、海马GABA阳性神经元明显减少，差异均有显著性意义(P<0.05)。川芎嗪干预后，大脑皮层、海马Glu阳性神经元明显减少，大脑皮层、海马GABA阳性神经元明显增多，差异均有显著性意义(P<0.05)。结论川芎嗪能上调GABA阳性神经元数目,下调Glu阳性神经元数目。川芎嗪可能通过抑制脑内Glu的产生，促进脑内GABA的产生，从而使神经元的兴奋性降低，抑制了癫痫的发生。

【关键词】  川芎嗪 癫痫 谷氨酸 γ-氨基丁酸 免疫组织化学

　　Study on the Effects of Tetramethylpyrazine in Treating Epilepsy and its Relation to Neurotransmitter

　　Abstract:ObjectiveTo study the effects of tetramethylpyrazine(TMP) in treating epilepsy and its relation to the neurotransmitters of glutamate(Glu) and γ-aminobutyric(GABA) . MethodsSD rats were selected and randomized into three groups: normal saline control group, pentylenetetrazol group and treatment of tetramethylpyrazine group. The changes of expression of Glu and GABA proteins in cortex and hippocampus of rats were detected by immunosuppressant method. ResultsThe expression of the Glu proteins in pentylenetetrazol groups were significantly higher than those in saline control groups. While the expression of GABA proteins in pentylenetetrazol groups were significantly lower than those in saline control groups (P<0.05). The expression of the Glu proteins in those intreatment of tetramethylpyrazine groups were significantly lower than those in pentylenetetrazol groups. While the expression of GABA proteins in intreatment of tetramethylpyrazine groups were significantly higher than those in pentylenetetrazol groups (P<0.05).ConclusionTetramethylpyrazine can upregulate the expression of GABA protein and downregulated the expression of Glu.Tetramethylpyrazine maybe reduce the nerve excitation and inhibit the epilepsy through inhibiting  the production of  Glu and increasing the production of GABA in brain of rats.

　　Key words:Tetramethylpyrazine(TMP)；  Epilepsy;  Glutamate(Glu)；  γ-aminobutyric(GABA)；  Immunosuppressant

    癫痫（epilepsy）是以神经元异常反复过度同步放电为特征的中枢神经系统临床综合征。谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）分别是脑内最主要的兴奋性和抑制性神经递质，二者共同维持着脑神经元兴奋与抑制的平衡，其平衡失调被认为是癫痫的始发因素之一。前期研究工作表明［1,2］：IL-1β，IL-6可诱发大鼠的癫痫发作行为，并通过升高Glu含量降低GABA的含量，使神经元兴奋性升高而促进癫痫发生。川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基比嗪（Tetramethylpyrazine ，TMP），在体内吸收后，能有效地透过血脑屏障,并广泛分布大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位［3,4］，对脑功能具有广泛调节作用，涉及了行为、学习、记忆和基因表达等多方面［5］。同时，笔者以往的研究证实［6～8］：川芎嗪能明显抑制大鼠癫痫模型的痫样放电，对大鼠癫痫模型神经细胞的损伤具有保护作用。本研究旨在通过癫痫动物模型检测川芎嗪预处理后对大鼠脑内谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric ，GABA）含量的影响，以探讨川芎嗪抑制癫痫的机制，从而为临床治疗癫痫提供充分的理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物分组及模型制备选用SD雄性大鼠(广州医学院实验动物中心提供)24只,体重160～200 g,实验室条件下喂养,随机分为3 组, 每组8只， A组：生理盐水对照组, 腹腔注射生理盐水，B组：戊四氮致痫组，腹腔注射戊四氮4 mg/kg, 诱发癫痫发作行为,C组：川芎嗪+戊四氮致痫组，腹腔注射川芎嗪40 mg/kg［6］，预处理10 min后，再腹腔注射戊四氮4 mg/kg（川芎嗪注射液40 mg/2 ml，北京第四制药有限公司生产，戊四氮，Sigma公司生产）。各组注射完毕后分别观察动物行为学表现2 h。再断头取脑。

　　1.2  组织制备每只动物均在戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉下行升主动脉灌流,先快注入生理盐水150 ml,然后滴注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液400 ml(pH 7.4),立即取脑,后固定6 h,入20%蔗糖液中过夜。次日，行恒冷箱切片(-20℃),留取含大脑颞、顶叶皮质及背侧海马最大断面的切片（30 μm）。

　　1.3  免疫组织化学SABC法切片用0.3 %H2O2-甲醇处理20 min,再入3%牛血清白蛋白孵育1 h,继而分别加入兔抗GABA血清(Sigma公司)1∶1 500或兔抗Glu血清(Sigma公司)1∶5 000,孵育48h ,生物素化羊抗兔IgG 1∶200，孵育1h,SA/HRP1∶200，孵育1 h。上述每步骤间用PBS充分漂洗,后入硫酸镍胺(GDN)显色液(0.006%DAB-0.025%硫酸镍胺-0.0004%葡萄糖氧化酶)显色10 min左右,并充分漂洗、贴片、晒干，常规脱水、透明、封片。

　　1.4  图像分析及统计处理采用HMIAS-2000 高清晰度彩色病理图文分析系统对图片进行图像分析。每例动物测两张切片, 每组共16 张切片, 每张切片在注射侧海马CA3区、齿状回及大脑皮质分别随机选取两个100×倍视野进行测量。分析指标: 平均光密度(OD)及细胞计数 。以上数据由分析系统自动计算。统计学处理采用配对t 检验。

　　2  结果

　　2.1  动物行为学表现根据Diehl［9］的评估标准，将大鼠的癫痫发作程度由轻到重分为0～Ⅵ级。A组在注射生理盐水后动物无癫痫发作；B组在注射戊四氮2 min后,阵发性竖毛,胡须抖动,前肢轻微震颤,持续2～3 min ,反复发作约40～50 min ,为癫痫发作Ⅲ～Ⅵ级；C 组在注射完后,动物表现与A组相似，未见明显癫痫发作。　　2.2  免疫组化结果各组大鼠Glu免疫反应阳性细胞平均光密度（OD值）(见表1)， 各组大鼠GABA免疫反应阳性细胞数(见表2)， 戊四氮组与正常对照组比，在大脑皮质、海马CA3区及齿状回Glu免疫反应阳性细胞平均光密度值（OD值）明显升高，GABA免疫反应阳性阳细胞数明显减少，差别均有显著性意义(P<0.05)，川芎嗪+戊四氮致痫组与戊四氮组比，在大脑皮质、海马CA3区及齿状回Glu免疫反应阳性细胞平均光密度值（OD值）明显降低，GABA免疫反应阳性阳细胞数明显增多，差别均有显著性意义(P<0.05)，川芎嗪+戊四氮致痫组与正常对照组比较，差别无显著性意义(P>0.05)。表1  各组大鼠Glu免疫反应阳性神经元平均光密度（OD值） (略)表2  各组大鼠GABA免疫反应阳性神经元数量(略)

　　3  讨论

    Glu和GABA分别是脑内最主要的兴奋性和抑制性神经递质，它们广泛地分布于各脑区［10，11］，二者不仅在功能上协调一致，共同维持着脑神经元兴奋与抑制的平衡，而且在代谢上密切相关，并可循环转换。癫痫的发生与它们的功能失衡有密切关系，因此，本实验着重研究川芎嗪预处理后，对大脑皮质和海马区域Glu及GABA免疫细胞化学反应的变化。结果发现，川芎嗪预处理后，大鼠大脑皮质顶叶、颞叶区、海马锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层和多形细胞层Glu免疫反应明显减弱，而GABA免疫反应在大脑皮质顶叶、颞叶、海马分子细胞层明显增强，图像分析显示差异具有统计学意义，此结果提示：川芎嗪抑制癫痫可能是通过调节Glu和GABA的代谢平衡，或调节二者的基因转录水平，而使兴奋性神经递质Glu含量和抑制性神经递质GABA的含量重新恢复平衡状态，使脑神经元兴奋性恢复正常，而抑制癫痫的发生。

    戊四氮是一种传统的致痫剂，有研究资料提示，戊四氮致痫的机制与GABAA受体系统有关。戊四氮可抑制GABAA受体导致Cl-内流减少，膜电位升高，神经元兴奋性增强，作者以往的研究也发现戊四氮可使Glu含量升高，Glu含量升高，可直接使神经元兴奋，导致癫痫的发作。本实验观察到川芎嗪预处理后，海马内GABA阳性神经元增多主要发生在其分子细胞层，根据海马的细胞构筑特点，在分子层内存在着一些中间神经元，它们是抑制性神经元，其功能是阻止兴奋扩散到海马的投射神经元，对投射神经元发放冲动起闸门控制作用［12］。结合本实验GABA免疫反应神经元在分子层的阳性表达变化，笔者推测本实验中增多的海马CA3区GABA能神经元可能就是这种抑制性中间神经元。而本实验Glu阳性神经元的减少在海马主要显现在锥体细胞层，后者正是海马的投射神经元。因此海马细胞构筑特性对本实验结果提供了形态学依据。海马区域神经元具有自发放电、兴奋阈值低的特性，因此与癫痫的发生有密切关系。川芎嗪也由于协调了海马内Glu和GABA神经元的功能平衡，从而抑制了癫痫的发生。

    本实验从形态学上直接证实了川芎嗪与Glu，GABA 的密切关系, 是在我们前期工作基础上的进一步深入, 使我们对川芎嗪调节神经兴奋性机制有了新的认识，同时也为中药的开发利用提供了新的线索。



【参考文献】
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